Механизмы антибиотикорезистентности микроорганизмов

Антибиотикорезистентность - это устойчи­вость микробов к антимикробным химиопре-паратам. Бактерии следует считать резистент­ными, если они не обезвреживаются такими концентрациями препарата, которые реально создаются в макроорганизме. Резистентность может быть природной и приобретенной.

Природная устойчивость. Некоторые виды микробов природно ус­тойчивы к определенным семействам антиби­отиков или в результате отсутствия соответс­твующей мишени (например, микоплазмы не имеют клеточной стенки, поэтому не чувстви­тельны ко всем препаратам, действующим на этом уровне), или в результате бактериальной непроницаемости для данного препарата (на­пример, грамотрицательные микробы менее проницаемы для крупномолекулярных соеди­нений, чем грамположительные бактерии, так как их наружная мембрана имеет «маленькие» поры).

Приобретенная устойчивость. Бактерии стали чрезвычай­но быстро приспосабливаться, постепенно формируя устойчивость ко всем новым пре­паратам. Приобретение резистентности — это биологическая закономерность, связанная с адаптацией микроорганизмов к условиям внешней среды. В разной степени резистентность характерна для всех бактерий и всех анти­биотиков. К химиопрепаратам адаптируются не только бактерии, но и остальные микро­бы — от эукариотических форм (простейшие, грибы) до вирусов. Проблема формирования и распространения лекарственной резистен­тности микробов особенно значима для внутрибольничных инфекций, вызываемых так называемыми «госпитальными штаммами», у которых, как правило, наблюдается множес­твенная устойчивость к антибиотикам (так называемая полирезистентность ). Бактерии, способные к полирезистентности, являются природными хранилища­ми генов лекарственной устойчивости. Как известно, мутации, в том числе по признаку лекарствен­ной устойчивости, спонтанны и возникают всегда.

Плазмидная устойчивость приобретается микробными клетка­ми в результате процессов генетического обмена. Сравнитель­но высокая частота передачи R-плазмид обеспечивает широкое и достаточно быстрое распространение устойчивых бактерий в популяции, а селективное давление антибиотиков - отбор и закрепление их в биоценозах. Плазмидная устойчивость может быть множественной, т. е. к нескольким лекарственным препаратам, и при этом достигать достаточно высокого уровня.

Биохимическую основу резистентности обеспечивают разные механизмы:

• энзиматическая инактивация антибиотиков - осуществляется с помощью синтезируемых бактериями ферментов, разрушаю­щих активную часть антибиотиков. Одним из таких широко известных ферментов является бета-лактамаза, обеспечиваю­щая устойчивость микроорганизмов к бета-лактамным анти­биотикам за счет прямого расщепления бета-лактамного кольца этих препаратов. Другие ферменты способны не расщеплять, а модифицировать активную часть молекулы антибиотиков, как это имеет место при энзиматической инактивации аминогликозидов и левомицетина;

• изменение проницаемости клеточной стенки для антибиотика или подавление его транспорта в бактериальные клетки. Этот механизм лежит в основе устойчивости к тетрациклину,

• изменение структуры компонентов микробной клетки, например изменение структуры бактериальных рибосом, сопровождается повышением устойчивости к аминогликозидам и макролидам, а изменение структуры РНК-синтетаз — к рифампицину.

У бактерий одного и того же вида могут реализовываться не­сколько механизмов резистентности. В то же время развитие того или другого типа резистентности определяется не только свойствами бактерий, но и химической структурой антибиотика.

Для борьбы с лекарственной устойчивостью, т. е. для преодоле­ния резистентности микроорганизмов к химиопрепаратам, су­ществует несколько путей:

• соблюдение принципов рациональной химио­терапии;

• создание новых химиотерапевтических средств, отличающихся механизмом антимикробного действия (например созданная в последнее время группа химиопрепаратов — фторхинолоны) и мишенями;

• постоянная ротация (замена) используемых в данном лечебном учреждении или на определенной территории химиопрепара­тов (антибиотиков);

• комбинированное применение бета-лактамных антибиотиков со­вместно с ингибиторами бета-лактамаз (клавулановая кислота, сульбактам, тазобактам).

5. Методы определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам

Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам методом серийных разведений (количественный метод). Данный метод определения антибиотикочувствительности является количественным и позволяет определить минимальную бактериостатическую и минимальную бактерицидную концентрации. Серийный метод титрования может быть выполнен в разных объемах среды (от 1 до 10 мл). Эксперименты выполняются в условиях асептики при использова­нии стерильных пипеток для каждого ингредиента реак­ции. Титрование можно проводить в плотных и жидких средах.

При титровании в жидких средах в ряд пробирок на­ливают питательную среду в строго определенном объе­ме. Количество пробирок определяется количеством раз­ведений препарата, которое необходимо взять в опыт. В 1-ю пробирку вносят определенное количество раство­ра антибиотика, перемешивают, затем определенный объ­ем смеси из 1-й пробирки переносят во 2-ю, перемешива­ют и переносят то же количество смеси из 2-й в 3-ю и т. д. Из последней пробирки, содержащей антибиотик, такой же объем смеси выливают, чтобы во всех пробирках объем жидкости был одинаков. Пробирка, не содержа­щая антибиотика, является контрольной. После этого во все пробирки, содержащие серийно разведенный анти­биотик, и в контрольную пробирку вносят одинаковое ко­личество взвеси тест-культуры. Штатив с про­бирками встряхивают и ставят в термостат при 37°С на 18—20 ч.

Кратность разведения антибиотика обычно выбира­ют равной двум, для этого в каждую пробирку наливают, например, по 1 мл бульона, в 1-ю пробирку вносят 1 мл раствора антибиотика и переносят из пробирки в' про­бирку по 1 мл смеси. При этом точность определения ак­тивности препарата составляет ±50%.

Взвесь клеток исследуемой культуры готовят на изотоничес­ком растворе хлорида натрия при обязательном сравне­нии со стандартами мутности. При титровании антибак­териальных антибиотиков микробная нагрузка обычно составляет 2, 5 × 10⁵ микробных клеток на 1 мл раствора антибиотиков в питательном бульоне. Для этого готовят взвесь тест-культуры по стандарту 10 ед. мутности, что составляет 1 млрд. микробных тел в 1 мл. Взвесь разво­дят изотоническим раствором до концентрации 2, 5× 10⁶ клеток в 1 мл и вносят в пробирки с серийно разведен­ным антибиотиком по 0, 1 мл на 1 мл питательного буль­она. При использовании в качестве тест-культуры дрож­жей микробная нагрузка составляет 4× 10⁶ клеток в 1 мл.

Метод серийных разведений в плотных средах отли­чается тем преимуществом, что микробы-загрязнители при этом легко выявляются и по существу не изменяют общих результатов титрования, тогда как на жидких средах весь опыт может оказаться безрезультатным из-­за попадания в пробирки хотя бы единичных клеток посторонних устойчивых микроорганизмов. Этот метод используют также при работе с микроорганизмами, ко­торые не растут на обычных жидких средах, например, микобактерии туберкулеза, которые выращивают на среде, содержащей свернутую сыворотку. Вначале гото­вят ряд серийных разведений антибиотика, а затем вно­сят по 1 мл каждого разведения в пробирку, содержа­щую 4 мл расплавленной и охлажденной до 45—50°С агаризованной среды. Затем пробирки скашивают до за­стывания агара, а на поверхность плотной среды петлей засевают взвесь тест-культуры.

Для выявления бактерицидного действия препарата делают высев на МПА из всех пробирок, где визуально не отмечен рост микроорганизма. Для стойких антимик­робных веществ, которые адсорбируются на микробных клетках и препятствуют их росту даже в свежей пита­тельной среде, применяют соответствующие нейтрализа­торы.

Определение чувствительности микроорганизмов методом дисков (качественный метод).

Рисунок 11. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам диско-диффузионным методом.

Ускоренный метод определения чувствительности микроорганизма к антибиотику

В чашку Петри наливают 15 мл питательного агара. После застывания агара на него наносят смесь 4 мл та­кого же агара, 1 мл взвеси тест-культуры (приготовлен­ной по стандарту 1 млрд микробных клеток в 1 мл) и 1 мл 0, 2% водного раствора 2, 6-дихлорфенолиндофенола (рН 7, 2—7, 3). Вместо культуры можно использовать клинический материал. Затем на застывший агар ярко-синего цвета наносят диски, пропитанные антибиотика­ми, и чашки ставят в термостат при 37°С. Через 2-4 ч учитывают результаты по диаметру синих зон отсутст­вия роста. Резистентные к антибиотику микроорганизмы восстанавливают краситель, обесцвечивая его или транс­формируя в желтый цвет. Данный краситель задержи­вает рост стафилококков, поэтому при работе с этим микроорганизмом раствор индикатора наливают на по­верхность чашки в количестве 2—3 мл уже после вы­держивания чашки с дисками в термостате. Избыток индикатора сливают через 5—7 мин и учитывают резуль­таты.

Элипсометрическийи метод (Е-тест) занимает промежуточное положение между методом бумажных дисков и методом серийных разведений, являясь качественно-количественным методом. В нем используется узкая полоска полимера, пропитанная разными концентрациями антибиотика (от минимальных до макси­мальных), которая наносится на поверхность плотной питательной среды, предварительно засеянной испытуемой культурой. Задержка роста культуры вокруг полоски наблюдается в той зоне, где концентрация антибиотика выше МИК. На поверхности полоски нанесены типографским способом величины концентрации антибиотика в каждом участке. Если культура обладает чувствительностью к антибиотику, то зона задержки роста имеет каплевидную (элипсовидную) форму. За величину минимальной ингибирующей концентрации (МИК) антибиотика принимают отрезок полоски, к которому вплотную подходит рост микроба.

Рисунок 12. Определение чувствительности микроорганизмов с помощью Е-тестов.

III. План практической работы

1. Определить спектр действия антибиотиков

2. Определить чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом серийных разведений (количественный метод)

3. Определить чувствительность микроорганизмов к антибиотикам методом бумажных дисков (качественный метод)

4. Определить чувствительность микрофлоры зева к антибиотикам с помощью Е-теста

5. Разобрать основные группы химиопрепаратов и антибиотиков

6. Заполнить таблицы «Классификация антимикробных препаратов по механизму действия»

7. Решить ситуационные задачи

УИРС Определить чувствительность микрофлоры зева к антимикробным препаратам.