Глава 16. Обменные процессы

Свободнорадикальное окисление липидов. РАВ являются антиоксидантами, которые препятствуют накоплению в организме свободных радикалов и противодействуют их неблагоприятному влиянию на организм человека. Полученные в нашей лаборатории данные свидетельствуют о том, что РАВ как in vitro, так и in vivo проявляют высокую антиоксидантную активность и по эффекту действия не уступают такому известному антиоксиданту, как бетаионол.

РАВ способны защищать наследственный аппарат клетки от свободных радикалов, которые могут разрушать клетки, нуклеиновые кислоты, мембраны клеток. Они защищают наследственный аппарат клетки от воздействия на него мутагенов, активно влияя на синтез ДНК, чем способствуют ее регенерации при повреждении [Абрамова Ж.И. и др., 1985].

Перекисное окисление липидов — универсальный процесс; он постоянно протекает в каждой клетке и в мембранных структурах. В тканях организма постоянно образуются свободные радикалы и перекисные соединения, которые участвуют в биохимических реакциях. Активация ПОЛ сопровождается повреждением белков, липидов, биомембран, инактивированием ферментов внутриклеточных органелл, вследствие чего нарушаются обменные процессы и физиологические функции в клетках, тканях, в целом организме, что в свою очередь может способствовать развитию патологических состояний. Цепной каскадный характер ПОЛ многократно усиливает первичное повреждающее действие. Продукты ПОЛ являются универсальными клеточными и субклеточными ядами.

Свободные радикалы (СР) — это обрывки молекул, имеющие неспаренный электрон. Их образование происходит при участии кислорода. Свободные радикалы могут вызывать цепные реакции, нарушать метаболические процессы и повреждать различные биоструктуры: белки, ДНК, нуклеиновые кислоты, т.е. повреждать генетический аппарат клетки.

В настоящее время накоплен материал, доказывающий большую роль радикалов в жизненно важных процессах. Общепризнано участие радикалов и среди них особенно активных форм кислорода в развитии старения, опухолей, воспалительных процессов, ИБС, атеросклероза, и это далеко не полный перечень.

Антиокислительная система (АОС) регулирует уровень свободнорадикальных реакций окисления, препятствуя накоплению токсичных продуктов окисления. В ее состав входят ферменты и природные антиоксиданты, встроенные в структуру мембран, тормозящие процессы ПОЛ и уменьшающие доступ кислорода к липидам. На функционирование АОС оказывают влияние экологические, сезонные, климатические и другие факторы. При чрезмерных окислительных свободнорадикальных реакциях АОС может истощиться. Эта система поддерживает на постоянном уровне процессы свободнорадикального окисления. Избыточное СРО и истощение АОС сопровождается накоплением продуктов ПОЛ, оказывающих отрицательное действие на различные биосубстраты. В подобных случаях возникает необходимость введения в организм природных антиоксидантов [Абрамова Ж.И., 1967; Калмыкова В.И., 1978]. Антиоксиданты — антиокислительные вещества, выполняющие в организме роль универсальных регуляторов и стабилизаторов окислительного гомеостаза; они связывают и обезжиривают свободные радикалы, регулируют и поддерживают низкий уровень свободнорадикальных процессов. Антиоксиданты обладают широким спектром физиологического действия, способностью изменять активность регулирующих систем организма. Антиоксиданты участвуют в формировании структурных элементов клетки. К антиоксидантам относятся витамины Е, А, К, С, В6, Р и другие природные вещества [БарабойВ.А., 1976, 1984].

Рис. 4. Влияние РАВ на показатели перекисного окисления липидов и концентрацию кислорода в тканях животных, длительно содержащихся в гермообъемах с разным составом газовых сред.

1 — показатели перекисного окисления липидов (ед/мл); 2 — показатели хемолюминесценции; 3 — концентрация кислорода в тканях (нг/атом/мл); а — естественная атмосфера; б — искусственная атмосфера; в — биогенезированная атмосфера.

Антиоксиданты вводят не только с целью снижения концентрации окислительных свободных радикалов за счет их связывания, но и для мобилизации резерва АОС.

Нами исследовано влияние РАВ на перекисное окисление липидов крыс (линии Wistar), находящихся в течение 3 мес в различных газовых средах. Установлена выраженная связь ПОЛ с РАВ. Так, в ЕА показатели ПОЛ равнялись 0, 92 ед/мл; ИА — 0, 4 ед/мл; БИА — 1, 4 ед/мл; показатели хемилюминесценции сыворотки крови — соответственно 381; 442 и 310 (рис. 4).

Таким образом, у животных в ИА наблюдались достоверные изменения ПОЛ. В БИА процессы ПОЛ нормализовались, приближаясь к показателям, зарегистрированным в ЕА.

АТФ в эритроцитах. Первичным источником энергии в организме животных и человека является химическая энергия пищевых веществ: белков, жиров, углеводов, выделяющаяся при их окислении. Первичным источником энергии для растений служат лучи солнца, энергия которых накапливается в процессе фотосинтеза. Эта энергия поступает человеку через растительную пищу. Энергию, поступающую от сжигания питательных веществ (дыхания) или в процессе фотосинтеза, клетки запасают в АТФ. Клетка благодаря АТФ может накапливать большое количество энергии и расходовать ее по мере необходимости: на синтез молекул белков, жиров, углеводов, на деление клеток, сокращение мышц, на перенос ионов натрия и калия через мембраны и др. Все эти процессы потребляют энергию, аккумулированную в АТФ. При необходимости под влиянием АТФазы — фермента, который содержится в мембранах всех организмов, одна фосфатная группа отщепляется от АТФ, и образуется АДФ.

Освобождающаяся энергия используется клетками для совершения различных работ. Когда молекула АДФ вновь заряжается энергией, она превращается в АТФ—клеточный аккумулятор, хранитель энергии.

Макроэнергетические соединения могут накапливаться не только в виде АТФ, но и в виде креатинфосфата [Сойфер В.Н., 1975].

Таким образом, АТФ является основным источником энергии, аккумулированной в клетках организма.

Исследовано влияние РАВ на содержание АТФ в эритроцитах крыс линии Wistar, находящихся в различных газовых средах. Установлена четкая зависимость содержания АТФ от РАВ. Так, в ЕА АТФ была на уровне 30, 1 мкг/мл. В ИА содержание АТФ снизилось до 23, 8 мкг/мл.

У крыс в БИА уровень АТФ превысил норму и составил 34, 2 мкг/мл.

Иначе говоря, РАВ способствуют восстановлению аккумуляции энергии АТФ в клетках до нормы.

Свободная энергия в эритроцитах. В организме постоянно протекают процессы обмена веществ, сопровождающиеся выделением энергии, которая используется для синтеза белков и нуклеиновых кислот, липидов, углеводов. Энергия необходима клеткам для совершения работы, выделения продуктов обмена и т.д. Если химический процесс протекает за счет энергии извне (эндотермически), он обозначается знаком «плюс» (+), если процесс сопровождается выделением тепла (экзотермически), такая реакция обозначается знаком «минус» (-).

Мы в течение 3 мес исследовали характер изменения свободной энергии в эритроцитах 3 групп крыс, находящихся в различных газовых средах: ЕА, ИА, БИА.

Рис. 5. Интегральные показатели биоэнергетики клеток крови крыс, содержащихся в условиях различных газовых сред.

а — естественная атмосфера; б — зависимость показателей биоэнергетики клеток крови животных, содержащихся в искусственной атмосфере, по отношению к клеткам крови животных, находящихся в естественной атмосфере; в — зависимость показателей биоэнергетики клеток крови у животных, содержащихся в искусственной, но биогенезированной атмосфере, по отношению к клеткам животных, находящихся в естественной атмосфере.

Исследования, проведенные на мониторе биологической активности ЛКТБ 2277 фирмы «LKB—Producted AB Stockholm» (Sweden), показали зависимость биоэнергетики эритроцитов от РАВ.

ВИА резко нарушились химические процессы, что сопровождалось выделением тепла: 556 усл.ед. (рис. 5). В БИА химические процессы практически протекали на том же уровне, что и в ЕА (исследования проведены на мониторинге биологической активности ЛКТБ 2277 фирмы «IKB-Producted AB»).

Таким образом, у животных в ИА наблюдалось резкое снижение свободной энергии. В БИА уровень свободной энергии приблизился к таковому в контрольной группе (ЕА) и даже незначительно превысил его (+ 32, 8 усл.ед.).

Мембраны клеток. Значение мембран в жизни человека разнообразно. Они передают различную информацию, регулируют многие внутриклеточные процессы, узнают себе подобные клетки, способны генерировать электрические импульсы. Мембраны регулируют поступление молекул и ионов в клетку и их обратный выход из клетки. В мембраны клетки включены рецепторы гормонов, пептидов и др., что обеспечивает точность регуляции и специфичность белков-рецепторов.

Не исключено также присутствие на клетках организма рецепторов для некоторых компонентов РАВ. Это подтверждается тем, что в состав ЭМ входят лейкины. Известно, что некоторые растительные лейкины (фитогемагглютинин, конковалин А и др.) обладают митогенной активностью, что позволяет предполагать наличие на мембранах лимфоцитов рецепторов по отношению к их компонентам.

Если это будет доказано, то расшифруется еще одна из сторон механизма действия РАВ.

В мембранах находятся различные ферменты, биооксиданты, возможно, и некоторые компоненты РАВ. Специальные мембраны органов чувств преобразуют энергию звука, света в электрические импульсы. Мембраны рецепторных клеток воспринимают и передают центральной нервной системе информацию о запахах [Бергельсон Л.Д., 1975; Сим Э., 1985; Райт Р.Х., 1966].

Проведены экспериментальные исследования влияния РАВ на проницаемость цитоплазматических мембран дрожжей аэробного типа метаболизма. Дрожжи культивировали в атмосфере, лишенной РАВ, и в такой же атмосфере с введением в ее состав РАВ розмарина в концентрации 0, 001 мг/м.куб. атмосферы.

В контрольном варианте дрожжи выращивали в естественной атмосфере.

При оценке действия атмосферы на метаболизм дрожжей была использована активность терминального фермента спиртового брожения — алкогольдегидрогеназы (АДГ) и арилэстеразы — фермента, участвующего в транспорте сильно диссоциированных органических кислот через цитоплазматическую мембрану. С целью изучения состояния цитоплазматических мембран определяли содержание эфиров высших жирных кислот в культуральной жидкости.

Установлено, что культивирование тест-объектов в атмосфере с отсутствием РАВ отражается на их метаболизме. Зарегистрировано достоверное снижение активности АДГ от 90, 4 до 0, 3 ед/г (Р< 0, 001) и арилэстеразы от 1200 до 850 ед/г (Р< 0, 05). Последнее, вероятно, связано с нарушением барьерной функции цитоплазматической мембраны.

Введение в атмосферу РАВ розмарина оказывает нормализующее действие на измененный метаболизм тест-объектов, снижая концентрацию эфиров высших жирных кислот и интенсифицируя активность АДГ и арилэстеразы, приближая ее к показателям контрольной группы.

Проведенные исследования указывают на перспективность дальнейшего изучения РАВ в качестве стабилизаторов мембранных структур.

Стабилизация цитоплазматических мембран наблюдалась нами в определенном интервале концентрации ЭМ от 0, 05 до 0, 0005%. При этом стабилизация мембран микробных клеток отмечена при значительно меньшей концентрации ЭМ, чем стабилизация мембран лимфоцитов. В ИА резистентность мембран практически не отличалась от ЕА (соответственно 0, 55 и 0, 53) и достоверно отличалась от резистентности мембран клеток в ИА (0, 53 и 0, 25 соответственно).

Приведенные данные свидетельствуют о том, что длительное (до 3 мес) отсутствие в атмосфере РАВ сопряжено с достоверным снижением резистентности мембран эритроцитов. Постоянная биогенизация атмосферы сопровождается восстановлением резистентности мембран до нормы.

Ионы калия и состояние трансмембранного потенциала. Большинство энергетических и электрофизиологических процессов в организме протекают с изменением концентрации электролита внутри и вне клеток. Калий является важнейшим внутриклеточным катионом. Наблюдаемый сдвиг в балансе калия обусловлен изменением его содержания в клетках. Калий принимает участие в аккумуляции и в освобождении энергии в организме.

Натрий — главный ион внеклеточной жидкости. Содержание К + в клетках в 20 раз выше, чем концентрация Na + (Na/K — 1: 20), а содержание внеклеточного К + в 28 раз меньше концентрации внеклеточного Na + (Na/K — 28: 1). Ионы натрия и калия стремятся уйти туда, где их концентрация меньше: ионы калия — из клетки, ионы натрия — в клетку.

Функцию по транспортировке ионов калия и натрия через биологические мембраны выполняет Na-K-зависимая АТФаза-фермент. Ка +-АТФаза восстанавливает исходные градиенты, откачивая наружу и закачивая К + внутрь нейрона. При снижении мембранного потенциала открываются Na-каналы. При этом в нейрон-клетку поступают положительные ионы, что приводит к перемене знака потенциала (минус — снаружи, плюс — внутри). Возбуждение распространяется по нейрону и аксону. К + каналы открываются позднее.

Градиент К + противоположен градиенту Na +, в связи с чем ионы К + перемещаются наружу, при этом мембранный потенциал возвращается к исходному состоянию.

Итак, поток Na + внутрь клетки приводит к переразрядке мембран, противоположно направленный поток К + — к восстановлению исходного потенциала покоя.

Нами исследовано влияние РАВ на проницаемость мембран клеток для ионов калия и состояние трансмембранного потенциала. В ЕА проницаемость мембран для калия составляла 0, 37. При длительном отсутствии РАВ в атмосфере гермообъема проницаемость мембран для ионов калия повысилась до 0, 6. В БИА показатели проницаемости мембран для ионов калия достоверно не изменялись.

Трансмембранный потенциал в ЕА составил 0, 55, в ИА — снизился до 0, 35, а в БИА — нормализовался (0, 53).

Таким образом, при отсутствии РАВ в атмосфере происходит снижение проницаемости мембран для ионов калия, трансмембранного потенциала. Биогенизация сопровождается нормализацией показателей трансмембранного потенциала и достоверно не влияет на проницаемость мембран для ионов калия.

Потребление кислорода клетками организма. Кислород жизненно необходим для осуществления всех функций организма, поскольку он участвует в нормальных окислительных реакциях. Более того, считают, что внутриклеточная активность кислорода может рассматриваться как необходимая стадия биоэнергетического обмена. Однако это явление рассматривается как универсальный механизм повреждения клетки. В биологических системах кислород обычно восстанавливается с помощью ферментов, что ведет к образованию его активных форм. Получены данные, что активные формы кислорода могут участвовать в формировании хронического процесса, например патологии печени [Логинов А.С. и др., 1994], т.е. избыточная концентрация кислорода в клетках создает опасность его токсического действия. В то же время радиозащитный эффект связан со снижением кислорода в тканях на 20—30%. Этот эффект универсален и занимает определенное место в механизме радиозащитного действия.

Поскольку кислород хорошо растворим в жирах, он легко проникает через липидный слой мембран и при этом может стать причиной образования свободных радикалов, активации ПОЛ. Определяющим фактором токсического действия кислорода является гидроксильный радикал ОН -, самый сильный окислитель, который образуется в реакциях радиолиза воды. Он и обусловливает повреждение ферментов, мембран, нуклеиновых кислот, полисахаридов, в результате чего нарушаются метаболизм тканей и клеточное дыхание.

В настоящее время проблеме активных форм кислорода придается большое значение. Знания о свободных кислородных радикалах важны не только для фундаментальных биологических исследований, но и для практических медицинских целей.

Кроме участия в обычных окислительных реакциях, кислород может окислять вещества в результате неферментных (боковых) реакций с молекулами клетки. В этих случаях кислород также способен повреждать клеточные структуры [Абрамова Ж.И. и др., 1985].

Противовесом кислороду служит постоянно функционирующая в организме противоокислительная биологическая защита, ведущую роль в которой играют природные противоокислительные соединения. Они регулируют потребление кислорода клетками организма, снимая тем самым опасность его токсического действия при избыточной концентрации. К ним относятся и РАВ. Однако вопрос влиянии РАВ на утилизацию кислорода клетками организма не изучен. Мы провели исследование этого вопроса. Опыты поставлены на трех группах крыс линии Wistar. Животных первой группы содержали в ЕА, второй — в ИА, третьей — в БИА. Длительность эксперимента — 3 мес. Кислород определяли в бедренных мышцах методом полярографии.

Установлено, что у крыс, находящихся в обычной атмосфере, концентрация кислорода в бедренных мышцах составила 206, 73 нг • атом/мл. В искусственной атмосфере эти показатели были выше, чем в естественной, — 309, 86 нг • атом/мл (Р< 0, 001). Можно предположить, что в искусственной атмосфере нарушен процесс реализации кислорода в тканях и повышенное содержание кислорода в организме может способствовать неспецифическим окислительно-восстановительным процессам. Ежедневная биогенизация искусственной атмосферы РАВ приводила к снижению концентрации кислорода в тканях до 86 нг • атом/мл (Р< 0, 001 по отношению к показателям в искусственной атмосфере).

Приведенные данные свидетельствуют о том, что РАВ регулируют потребление кислорода клетками, снимая тем самым опасность его токсического действия при избыточной концентрации.

Были изучены изменения иммунологической системы экспериментальных животных, длительное время находящихся в искусственной атмосфере гермообъема, и возможность патогенетической профилактики этих расстройств с помощью растительных ароматических веществ.

На 30-е сутки от начала эксперимента у части животных исследовали цитолитическую активность лимфоцитов и гуморальный иммунный ответ на эритроциты барана. Остальных животных забивали на 90-е сутки. У них определяли массу тела и уровень кортикостерона в сыворотке крови.

Длительное пребывание в ИА сопровождалось развитием дисбаланса со стороны иммунологической системы. Нарушалась как Т-, так и В-система иммунного ответа. Так, на 30-е сутки повышалась функция Т-лимфоцитов, опосредующих ГЗТ на стимуляцию корпус-кулярным антигеном, высокой оставалась активность Т-клеток в реакции на растворимый антиген. Одновременно снижалась цитолитическая активность NK-клеток (табл. 3). Со стороны гуморального иммунного ответа на 30-е сутки наблюдались депрессия антителообразующей функции В-клеток и снижение титра гемагглютининов (табл. 4).

Таблица 3. Цитолитическая активность спленоцитов крыс на 30-е сутки пребывания в искусственной газовой среде гермообъема

* Здесь и далее достоверность различий при Р< 0, 05.

Таблица 4. Гуморальный иммунный ответ на эритроциты барана крыс на 30-е сутки пребывания в искусственной газовой среде гермообъема

Учитывая, что условия пребывания животных обеих групп различались только отсутствием естественного фона РАВ у крыс контрольной группы, было сделано предположение, что введение в такую атмосферу летучих фракций РАВ может обеспечить профилактику дисфункции иммунной системы.

Действительно, внесение РАВ монарды обеспечивало восстановление как цитолитической активности спленоцитов, так и активности Т-лимфоцитов на растворимый антиген (табл. 5).

Таблица 5. Цитолитическая активность спленоцитов крыс на 30-е сутки пребывания в искусственной газовой среде гермообъема, обогащенной РАВ монарды

Наблюдаемое восстановление литической активности NK-клеток при биогенизации ИА имеет существенное значение, поскольку NK-клетки способны лизировать опухолевые клетки и клетки, пораженные вирусом, тем более, что одновременно повышается и активность Т-лимфоцитов.

Иммунопротекторное действие РАВ при введении в ИА четко реализовалось на уровне гуморального иммунного ответа: повышалась антителопродуцирующая функция В-клеток, одновременно увеличивался титр гемагглютининов (табл. 6).

Таблица 6. Гуморальный иммунный ответ на эритроциты барана, крыс на 30-е сутки пребывания в газовой среде гермообъема, обогащенной РАВ монарды

На 90-е сутки эксперимента наблюдались нормализация функциональной активности Т-лимфоцитов и выраженная активация гуморального иммунного ответа, что проявлялось в увеличении числа АОК, общих гемагглютининов и Ig G (табл. 7).

Таблица 7. Гуморальный и клеточный иммунный ответ у крыс, пребывавших в течение 90 сут в ИА и ИА, обогащенной РАВ монарды

Активация гуморального иммунного ответа на 90-й день пребывания животных в ИА отражает, по-видимому, высокую чувствительность Т-супрессоров к глюкокортикоидам.

Возможно, положительный эффект РАВ монарды базируется на их стресслимитирующем действии, ибо введение монарды в искусственную газовую среду гермообъема сопровождалось снижением уровня кортикостерона (табл. 8) в сыворотке крови и его катаболитического действия в виде менее выраженного падения массы тела у животных опытной группы (табл. 9).

Таблица 8. Концентрация кортикостерона в сыворотке крови крыс на 90-е сутки пребывания в камерах с разной газовой средой

Таблица 9. Масса тела крыс на 90-е сутки пребывания в камерах с разной газовой средой

Таким образом при длительном пребывании организма в гермообъеме, особенно в условиях ИА, он отвечает неспецифической нейрогуморальной реакцией (стрессом), что сопровождается повышением кортикостерона в крови. Эта реакция направлена на сохранение гомеостаза организма и непосредственно связана с возможностью профилактики ряда инфекционных и неинфекционных заболеваний (опухоли, ИБС, гипертензия, язвенная болезнь, патология нервной системы, ОРЗ и др.).

Длительное пребывание в ИА сопровождается развитием дисбаланса в иммунологической системе. Нарушается как Т-, так и В-система иммунного ответа и реализуется как на уровне эффекторных клеток (Т-ГЗТ, NK-клеток, АОК), так и на уровне регуляторных лимфоцитов — Т-супрессоров.

Основным патологическим фактором, обусловливающим формирование дисбаланса, в наших экспериментах является стресс. Установлена роль глюкокортикоидного компонента стресса в патогенезе иммунных нарушений.

Профилактика стресса — это профилактика иммунодепрессий, которые могут формироваться в условиях ИА.

Обнаружено стресслимитирующее и иммунопротекторное действие РАВ, вводимых в ИА. Приведенные данные свидетельствуют о целесообразности курсового использования РАВ для профилактики стрессиндуцирующих дисфункций иммунной системы в условиях ГО.

Материалом исследования служила также поверхностно-активная фракция, выделенная из трахеобронхиальных смывов 30 крыс линии Wistar, содержавшихся в течение 3 мес в термокамерах. Поверхностно-активную фракцию выделяли по методу Абрамса. Поверхностную сурфактантную активность легких (СЛ) оценивали по величине минимального поверхностного натяжения (ПН мин), которое измеряли на весах Вильгельми—Лэнгмюра (определение СЛ проводила Г.Н.Паневская).

Как показали результаты исследований, поверхностная активность СЛ крыс, находившихся в искусственной газовой среде, была ниже, чем в контроле. Введение в состав атмосферы эфирного масла лаванды способствовало повышению поверхностной активности СЛ: ПН мин понижалось до 19, 74 мН/м (Р< 0, 05 в сравнении со второй группой наблюдений).

Таким образом, введение в состав искусственной атмосферы летучих фракций эфирного масла лаванды в концентрации 0, 5 мг/м.куб. позволяет нормализовать поверхностную активность СЛ, что обосновывает использование масла лаванды для профилактики развития патологических процессов, связанных с дефицитом СЛ (ателектаз, развитие нарушений бронхиальной проходимости и пр.).

Таким же свойством обладает и ЭМ монарды (в условиях содержания в обычной атмосфере). ЭМ эвкалипта и мяты по результатам опытов не влияют на поверхностную активность СЛ.