Молекулярные механизмы процессов энергетического сопряжения, хемиосмотическая теория Митчела.

В течение длительного времени считали, что АТФ и другие высокоэнергетические соединения, находящиеся в равновесии с ним, представляют собой единственную форму энергии, которая может использоваться живыми клетками во всех энергозависимых процессах. Вопрос о характере связи между транспортом электронов, с одной стороны, и превращением фосфорных соединений, с другой, долгое время оставался неясным. Было установлено, что использование энергетических ресурсов (органических или неорганических соединений при дыхании, света при фотосинтезе) связано с переносом электронов по цепи, состоящей из белковых и небелковых компонентов, способных к обратимому окислению — восстановлению. В результате этого переноса освобождающаяся на отдельных участках дыхательной или фотосинтетической цепи энергия трансформируется в химическую энергию фосфатных связей АТФ. Молекулярный механизм фосфорилирования, сопряженный с электронным транспортом, был неизвестен.

П. Митчелл высказал предположение, что система переноса электронов и протонов и переносящая протоны АТФаза возникли независимо друг от друга и, вероятно, неодновременно как разные способы генерации Арн+, необходимого для обеспечения энергией процесса избирательного транспорта питательных веществ в клетку. Последующая встреча обеих систем в клетке положила начало сопряжению процессов транспорта электронов и фосфорилирования в результате обращения работы АТФазы. Это сделало возможным запасание свободной энергии окисления в молекулах АТФ. Близкий состав и аналогичная структура энергопреобразующих мембран, большое сходство механизмов сопряжения у разных групп прокариот и эукариот указывают на то, что возникшая на раннем этапе эволюции система сопряжения электронного транспорта и фосфорилирования была использована всеми организмами без принципиальных изменений.

32. Молекулярные механизмы рецепторных процессов: G-белки, участие в трансдукции рецепторного сигнала.

G-белки (ГТФ-связывающие белки) - универсальные посредники при передаче сигналов от рецепторов к ферментам клеточной мембраны, катализирующим образование вторичных посредников гормонального сигнала. G-белки - олигомеры, состоящие из α, β и γ -субъединиц. Состав димеров β γ незначительно различаются в разных тканях, но в пределах одной клетки все G-белки, как правило, имеют одинаковый комплект β γ -субъединиц. Поэтому G-белки принято различать по их α -субъединицам. Выявлено 16 генов, кодирующих различные α -субъединицы G-белков. Некоторые из генов имеют более одного белка,, вследствие альтернативного сплайсинга РНК.

Каждая α -субъединица в составе G-белка имеет специфические центры: связывания ГТФ или ГДФ; взаимодействия с рецептором; связывания с β γ -субъединицами; фосфорилирования под действием протеинкиназы С; взаимодействия с ферментом аденилатциклазой или фосфолипазой С.

Различают неактивную форму G-белка - комплекс α β γ -ГДФ и активированную форму α β γ -ГТФ. Активация G-белка происходит при взаимодействии с комплексом активатор-рецептор, изменение конформации G-белка снижает сродство α -субъединицы к молекуле ГДФ и увеличивает к ГТФ. Замена ГДФ на ГТФ в активном центре G-белка нарушает комплементарность между α -ГТФ и β γ -субъединицами. Рецептор, связанный с сигнальной молекулой, может активировать большое количество молекул G-белка, таким образом обеспечивая усиление внеклеточного сигнала на этом этапе Активированная α -субъединица G-белка (α -ГТФ) взаимодействует со специфическим белком клеточной мембраны и изменяет его активность. Такими белками могут быть ферменты аденилатциклаза, фосфолипаза С, фосфоди-эстераза цГМФ, Nа+-каналы, К+-каналы.

Следующий этап цикла функционирования G-белка - дефосфорилирование ГТФ, связанного с α -субъединицей, причём фермент, катализирующий эту реакцию, - сама α -субъединица.

Дефосфорилирование приводит к образованию комплекса α -ГДФ, который не комплементарен специфическому белку мембраны (например, аденилатциклазе), но имеет высокое сродство к ру-протомерам. G-белок возвращается к неактивной форме - α β γ -ГДФ. При последующей активации рецептора и замене молекулы ГДФ на ГТФ цикл повторяется снова. Таким образом, α -субъединицы G-белков совершают челночное движение, перенося стимулирующий или ингибирующий сигнал от рецептора, который активирован первичным посредником (например, гормоном), на фермент, катализирующий образование вторичного посредника.

33. Молекулярные механизмы рецепторных процессов: аденилатциклазный путь трансдукции рецепторного сигнала.

Фермент аденилатциклаза, катализирующий превращение АТФ в цАМФ (рис. 5-36), - ключевой фермент аденилатциклазной системы передачи сигнала. Аденилатциклаза обнаружена во всех типах клеток.

Фермент относят к группе интегральных белков клеточной мембраны, он имеет 12 трансмембранных доменов. Внеклеточные фрагменты аденилатциклазы гликозилированы. Цитоплазматические домены аденилатциклазы имеют два каталитических центра, ответственных за образование цАМФ - вторичного посредника, участвующего в регуляции активности фермента протеинкиназы А.

На активность аденилатциклазы оказывают влияние как внеклеточные, так и внутриклеточные регуляторы. Внеклеточные регуляторы (гормоны, эйкозаноиды, биогенные амины) осуществляют регуляцию через специфические рецепторы, которые с помощью α -субъединиц G-белков передают сигналы на аденилатциклазу. α s-Субъединица (стимулирующая) при взаимодействии с аденилатциклазой активирует фермент, α -субъединица (ингибирующая) ингибирует фермент. В свою очередь, аденилатциклаза стимулирует проявление ГТФ-фосфатазной активности α -субъединиц. В результате дефосфорилирования ГТФ образуются субъединицы α s-ГДФ и α i-ГДФ, не комплементарные аденилатциклазе.

Из 8 изученных изоформ аденилатциклазы 4 - Са2+-зависимые (активируются Са2+). Регуляция аденилатциклазы внутриклеточным кальцием позволяет клетке интегрировать активность двух основных вторичных посредников цАМФ и Са2+.

Адениладциклазный путь: с рецептором связывается гормон. При этом активируется G-белок. Его альфа- субъединица связана с GDP. При активации GDP отделяется, а с альфа-субъединицей связывается GTP.Комплекс GTP с альфа- субъединицей отделяется от рецептора и от двух других субъединиц G- белка. Он активирует аденилатциклазу (AC). Связывание приводит к освобождению каталитической субъединицы (С), которая фосфорилирует несколько белков в цитоплазме, включая онко белок Raf. В результате стимулируется или, наоборот, ингибируется пролиферация клетки.

34. Молекулярные механизмы рецепторных процессов: вторичные мессенджеры, характерные свойства вторичных мессенджеров.

Вторичные мессенджеры, или посредники, это внутриклеточные вещества, концентрация которых строго контролируется гормонами, нейромедиаторами и другими внеклеточными сигналами (см. с. 372). Такие вещества образуются из доступных субстратов и имеют короткий биохимический полупериод. Наиболее важными вторичными мессенджерами являются цАМФ, цГТФ, Са2+, инозит-1, 4, 5-трифосфат, диацилглицерин и монооксид азота (NO).

Циклический АМФ

циклоаденозинмонофосфат, синтезируется мембранными аденилатциклазами — семейством ферментов, катализирующих реакцию циклизации АТФ с образованием цАМФ и неорганического пирофосфата. Расщепление цАМФ с образованием АМФ катализируется фосфодиэстеразами, которые ингибируются при высоких концентрациях метилированных производных ксантина, например кофеином.

цАМФ является аллостерическим эффектором протеинкиназ А и ионных каналов. В неактивном состоянии ПК-Α является тетрамером, две каталитические субъединицы (К-субъединицы) которого ингибированы регуляторными субъединицами (Р-субъединицы) (аутоингибирование). При связывании цАМФ Р-субъединицы диссоциируют из комплекса и К-единицы активируются.

Роль ионов кальция

Концентрация ионов Са2+ в цитоплазме нестимулированной клетки очень низка (10-100 нМ). Низкий уровень поддерживается кальциевыми АТФ-азами (кальциевыми насосами) и натрий-кальциевыми обменниками. Резкое повышение концентрации ионов Са2+ в цитоплазме (до 500-1000 нМ) происходит в результате открывания кальциевых каналов плазматической мембраны или внутриклеточных кальциевых депо (гладкого и шероховатого эндоплазматического ретикулума). Открывание каналов может быть вызвано деполяризацией мембран или действием сигнальных веществ и тд.

Действие кальция опосредовано специальными Са2+-связывающими белками («кальциевыми сенсорами»), к которым принадлежат аннексин, кальмодулин и тропонин

Инозит-1, 4, 5-трифосфат и диацилглицерин

Гидрофильный ИФ3 поступает в эндоплазматический ретикулум [ЭР (ЕR)] и индуцирует высвобождение ионов Са2+ из запасающих везикул.

35.Молекулярные механизмы рецепторных процессов: фосфоинозитидный путь трансдукции рецепторного сигнала.

Фосфоинозитидный путь передачи информации

В этом механизме передачи сигнала в клетку активное участие принимают мембранные фосфолипиды, в частности, фосфа-тидилинозитол, на долю которого приходится от 2 до 8 % фосфолипидов клеточных мембран.

Внешний сигнал после взаимодействия с рецептором активирует Gp-белок, а затем — “усилительный” фермент — фосфодиэстеразу (фосфолипазу С), которая расщепляет фосфа-тидилинозитол-4, 5-дифосфат (Р1Р2) на водорастворимый инози-тол-1, 4, 5-трифосфат (1Р3) и липидорастворимый диацилглице-рол (DG). Инозитолтрифосфат и диацилглицерол являются вторичными мессенджерами. Гидрофильный инозитолтрифосфат диффундирует в цитоплазму и вызывает освобождение ионов Са2+ из внутриклеточных депо. Ионы кальция образуют комплекс с Сай-свя-зывающим белком кальмодулином (СаМ), активирующим киназу, катализирующую фосфорилирование неактивного белка. Активация фосфорилированного белка обусловливает развитие клеточного ответа.

Оставшийся в мембране диацилглицерол активирует проте-инкиназу С (С-киназу). Протеинкиназа С в присутствии кислого фосфолипида — фосфатидилсерина и ионов кальция катализирует присоединение фосфата к неактивному белку. В результате фосфорилирования белка развивается ответная реакция клетки. Диацилглицерол может подвергаться дальнейшим превращениям. Диацилглицеролкиназа в присутствии АТР фосфорилиру-ет диацилглицерол с образованием фосфатидной кислоты. Предполагают, что последняя способна выполнять роль ионофора (подвижного переносчика) для ионов кальция. При переносе этих ионов через плазматическую мембрану образуются участки с не-бислойной структурой, т.е. каналы для проникновения ионов Са2+. Кроме того, под действием диацилглицероллиназы из диацил-глицерола образуется арахидоновая кислота, окисляющаяся затем до биологически активных метаболитов — эйкозаноидов, которые сами являются эффективными модуляторами разнообраз-

ных реакций в клетке. Фосфоинозитиды регулируют процессы деления клеток, секреции гормонов, транспорта ионов.

Необходимо отметить, что вышеописанные механизмы передачи информации имеют много общих черт и включают реализацию трех основных этапов:

— взаимодействие рецептора с первичным мессенджером;

— изменение конформации и функциональных свойств мембранных белков-посредников (белка-“преобразователя” и фермен-та-“усилителя”);

— активацию вторичных мессенджеров, взаимодействие которых с определенными структурными компонентами клетки индуцирует быстрое распространение сигнала по всей клетке.

36. Облегчённая диффузия. Характеристика процесса. Транспорт глюкозы в эритроцит

Облегченная диффузия. Отличается от пассивной диффузии тем, что в этом случае перенос осуществляется за счет уникальных белков­переносчиков. Роль этих белков заключается в том, чтобы провести гидрофильное вещество через гидрофобный слой мембраны. Для этого вида транспорта характерна высокая избирательность. Этот вид транс­порта имеет огромное значение для эритроцитов и клеток мозга. В эритроцитах белок-переносчик встроен в мембрану и при том таким об­разом, что он гликозилируется на наружной стороне мембраны, где на­ходится доступная сульфгидрильная группа. Подсчитано, что на одну клетку приходится 200 000 таких центров, каждый из которых перено­сит 500 молекул глюкозы в секунду. Благодаря этому механизму, эрит­роциты поглощают глюкозу примерно в 10 000 быстрее, чем это проис­ходило бы путем пассивной диффузии через мембрану.

Такая система действует также в мышцах и мозге.

Этот вид транспорта осуществляется хотя и с помощью белка-пере­носчика, но без затраты АТФ и происходит по градиенту концентрации, поэтому относится к пассивномутранспорту.

Такой вид транспорта играет особо важную роль для нервных кле­ток. Дело в том, что из-за наличия гемато-энцефалического барьера в клетки мозга не могут проникать крупные молекулы, такие как жиры и жирные кислоты. Поэтому для энергетических нужд мозг использует только глюкозу. Именно поэтому важно, чтобы в крови концентрация глюкозы была постоянно выше, чем в нервных клетках, и не должна па­дать ниже определенного критического уровня.

Транспорт глюкозы может происходить по типу как облегченной диффузии, так и активного транспорта, причем в первом случае он протекает как унипорт, во втором – как симпорт. Глюкоза может транспортироваться в эритроциты путем облегченной диффузии. Константа Михаэлиса (Кm)для транспорта глюкозы в эритроциты составляет приблизительно 1, 5 ммоль/л (то есть при этой концентрации глюкозы около 50% имеющихся молекул пермеазы будет связано с молекулами глюкозы). Поскольку концентрация глюкозы в крови человека составляет 4-6 ммоль/л, поглощение ее эритроцитами происходит практически с максимальной скоростью. Специфичность пермеазы проявляется уже в том, что L-изомер почти не транспортируется в эритроциты в отличие от D-галактозы и D-маннозы, но для достижения полунасыщения транспортной системы требуются более высокие их концентрации. Оказавшись внутри клетки, глюкоза подвергается фосфорилированию и более не способна покинуть клетку. Пермеазу для глюкозы называют также D-гексозной пермеазой. Она представляет собой интегральный мембранный белок с молекулярной массой 45кД.

Глюкоза может также транспортироваться Na+ -зависимой системой симпорта, обнаруженной в плазматических мембранах ряда тканей, в том числе в канальцах почек и эпителии кишечника. При этом одна молекула глюкозы переносится путем облегченной диффузии против градиента концентрации, а один ион Na – по градиенту концентрации. Вся система в конечном счете функционирует за счет насосной функции Na+ /K+ - АТФазы. Таким образом, симпорт является вторичной системой активного транспорта. Аминокислоты транспортируются аналогичным образом.

37. Образование свободных радикалов в тканях в норме и при патологических процессах. Перекисное окисление мембранных липидов: стадии процесса.

Свободные радикалы – это такая частица атомов молекулы, кот. имеет на внешн. оболочке один или несколько неспаренных электронов.

Механизм образования своб. рад.:

-их взаимодействие с Ме переменной валентности (р-ция Фентона).

Fe²⁺+H₂0₂=Fe³⁺+OH^-+OH^.(радикал гидроксила)

Fe²⁺+H₂0₂=Fe²⁺+H⁺+OOH^.(гидродиоксил)

-благодаря действию на них внешних факторов (t, ксенобиотики)

Радикалы в орг-ме чел-ка:

1. Природные (первич., вторич., третич.)

2. Чужеродные (радиация, УФ, ксенобиотики)

Первичные радикалы – образ-ся при участии специфических ферментативных систем (супероксид, нитроксид).

Втор. рад. – образ-ся в неферментат. р-циях и не выполн. физиологически полезных ф-ций. (радикал гидроксила, липидные радикалы).

Третичные радикалы – антиоксиданты (исп. для защиты организма от возд-я вредных радикалов) – альфа токоферол, тироксин, восст-й убехинон, женские стероидные гормоны.

HO(р) -> \LN|HOH L (р) -> \OO LOO(р) -> \LN|LOOH L(р) -> \OO LOO(р) -> обрыв (в результ-те взаим-я своб-х радикалов)

HO(р)+LH-> H20+L(р)

L(р)+O2-> LOO(р)

LOO(р)+LH-> LOOH+L(р)

FE2++LOOH-> FE3++HO-+LO(р)

LO(р)+LH-> LOH+L(р)

L(р)+O2-> LOO(р)-> ИТД