Механизм синтеза эукариотической ДНК

Выше указывалось, что для инициации репликации ДНК, каждая точка начала репликации связывает комплекс [ORC · Cdc6p · Cdt1] и множество гексамерных комплексов Mcm. (Описание основных ферментов и белковых факторов, участвующих в репликации эукариотической ДНК приведено в табл. 4.2). Вполне понятно, что для начала репликации спаренные цепи материнской двойной спирали должны быть разделены. Это позволит ДНК-полимеразе связаться с ДНК и приступить к синтезу дочерних цепей.

Таблица 4.2

Ферменты и белковые факторы, необходимые для репликации ДНК в экстрактах эукариотических клеток

^*Идентичность (тождественность) некоторых компонентов включаемых в реакции, приведенные в таблице, были впервые составлены, используя модель репликации ДНК in vitro. Эти системы базировались на процессе репликации ДНК в экстрактах клеток инфицированных вирусом SV40. Данный вирус обладает небольшим кольцевым геномом с определенной точкой начала репликации. Основная причина, почему вирус SV40 является настолько подходящей модельной системой для изучения репликации ДНК, заключается в том, что вирус использует только один вирусный белок – большой Т антиген – для его собственной репликации. Все остальные ферменты и белковые факторы репликации предоставляются клеткой-хозяином.

^† Если не указано отдельно, размеры субъединиц приведены для белков человека.

Репликация ДНК начинается с фосфорилирования Cdc6p и белков комплекса Mcm (см. рис. 4.17А). Роль фосфорилирования комплекса Mcm (с участием киназы Cdc7p-Dbf4p) еще до конца не установлена. Фосфорилирование же белка Cdc6p киназой Cdk2-циклин А (как указывалось выше) служит причиной того, что этот белок утрачивает способность взаимодействовать с белками Mcm, помогая тем самым начать репликацию. Фосфорилированные Cdc6p и Cdt1 покидают ДНК и движутся в цитоплазму (третий механизм регуляции «лицензирования»), где их судьба различна у разных организмов.

Например, в клетках млекопитающих изолированный в цитоплазме Cdc6p достаточно стабилен и используется повторно для связывания с точками начала репликации. У дрожжей цитоплазматический Cdc6p подвергается полному разрушению.

Исследования репликации ДНК у эукариот позволили установить, что следующий этап заключается в активации Mcm-геликазы (путем ее фосфорилирования) – фермента, который, используя энергию гидролиза АТР, разделяет спаренные цепи двойной спирали ДНК.

Высвобождение Cdc6p сопровождается связыванием c ДНК в точке начала репликации белка Cdc45p и ssb-белков эукариот – RP - A (рис. 4.17В). Полагают, что взаимодействие Cdc45p с комплексом Mcm способствует последующему связыванию белков RP-A с одноцепочечными участками ДНК. В настоящее время кажется вполне вероятным, что этот ассоциат тем или иным способом дополнительно активирует Mcm-геликазу. На следующей стадии белки Cdc45p и RP-A привлекают в точку начала репликации ДНК-полимеразу a (рис. 4.17С). По мере того, как геликаза начинает разделять цепи ДНК, двигаясь в двух противоположных направлениях от точки начала репликации, белки RP-A стабилизируют разделенные цепи так, что исчезает потенциальная возможность спаривания оснований в пределах одной и той же одиночной цепи.

Разделенные цепи двойной спирали ДНК готовы на этом этапе к процессу удвоения, но синтез цепей ДНК всегда включает присоединение приходящих нуклеозидтрифосфатов к свободной 3^/-ОН-группе на конце предсуществующего полинуклеотида. Каким образом в отсутствие предсуществующей цепи ДНК со свободным 3^/-ОН-концом ДНК-полимераза может осуществить начало синтеза? Эта проблема успешно разрешается благодаря участию ДНК-зависимой РНК-полимеразы, называемой праймазой, которая подобно другим РНК-полимеразам может инициировать синтез олигонуклеотида de novo, не нуждаясь при этом в наличии готового 3^/-ОН-конца. У эукариот синтез цепей ДНК в любом случае начинается с участием всех субъединиц ДНК-полимеразы α и праймазы, которые в целом известны как комплекс ДНК-полимераза α /Праймаза. Праймаза синтезирует комплементарный материнской цепи фрагмент РНК размером около 10 нуклеотидов, к которому ДНК-полимераза α присоединяет 20-30 дезоксинуклеотидов, так называемой инициаторной ДНК (iДНК) (см. рис. 4.17D и Е). Эти инициаторные реакции синтеза ДНК являются потенциально опасными для этой информационной молекулы, поскольку ДНК-полимераза α не обладает какой-либо корректирующей активностью. Любые ошибочно присоединенные основания неизбежно вызовут появление мутации. Из сказанного выше следует, что все события, характерные для инициации репликации полного генома, потенциально могут приводить к появлению ошибок в структуре ДНК. Поэтому и РНК-праймер, и большая часть или даже вся iДНК, синтезированные с участием комплекса Polα /Primase, впоследствии замещаются «правильными» дезоксинуклеотидами.

После того, как комплекс ДНК-полимераза α /Праймаза выполнил свою функцию, в репликацию включаются два других важных фактора. В частности, пентамерный белковый комплекс называемый RFC ( r eplication f actor C ) связывается с 3^/-концом инициаторной ДНК. Фактор RFC, используя энергию гидролиза АТР, обеспечивает присоединение к ДНК тримерного белка PCNA (рис. 4.17F и 4.17G). Тример PCNA имеет муфтообразную форму и после того как ДНК встраивается в его центральный канал, PCNA топологически защелкивается на материнской цепи ДНК. Связывание фактора RFC и защелкивание PCNA приводит к вытеснению комплекса ДНК-полимераза α /Праймаза и затем PCNA обеспечивает связывание ДНК-полимеразы δ (возможно и ДНК-полимеразы ε) с ДНК в области присутствия 3^/-концевой ОН-группы инициаторной ДНК. Двигаясь вместе с тримером PCNA, который используется как подобие скользящей «платформы», ДНК-полимераза δ приступает к синтезу непрерывной дочерней цепи ДНК (рис. 4.17Н). На отстающей цепи ДНК-полимераза ε синтезирует фрагмент из примерно 250 нуклеотидов до тех пор, пока не натолкнутся на следующий фрагмент Оказаки. В настоящее время считают, что Cdc45p является тем остó вным фактором, который удерживает вместе гексамерную Mcm-геликазу и репликативные ДНК-полимеразы по мере движения репликативной вилки.

Как ДНК-полимераза δ, так и ДНК-полимераза ε обладают корректирующей экзонуклеазной активностью. Это позволяет им контролировать правильность присоединения нуклеотидов в новосинтезированной цепи ДНК и исправлять любые ошибки, которые они могут допустить в ходе реакции полимеризации. Данная способность ДНК-полимераз δ и ε к самокоррекции объясняет ту поразительную точность, с которой проходит репликация ДНК (обычно частота ошибок не превышает 1 на 10⁹ пар оснований в реплицированной молекуле).

На заключительных стадиях репликации ДНК происходит удаление РНК-праймеров (а также инициаторной ДНК) и лигирование соседних фрагментов новосинтезированной ДНК. Удаление праймера может быть выполнено двумя способами (рис. 4.17I). С одной стороны, специфичная к РНК экзонуклеаза, называемая РНКазой Н (Rnase H), может выщеплять рибонуклеотиды праймера с его 5^/-конца. Однако этот фермент не в состоянии удалить последний рибонуклеотид, который соединен с инициаторной ДНК. Его удаление требует присутствия другой нуклеазы, называемой Fen1. Белок Fen1 (являющийся экзонуклеазой) способен удалить весь праймер, но для этого требуется участие геликазы. В этом случае геликаза должна разделить цепочку праймера (а также инициаторной ДНК) и материнскую ДНК, создавая при этом как бы «ус». Затем Fen1 удаляет ненужные нуклеотиды, входящие в состав отделенного «уса» путем их отщепления в одну стадию по месту соединения с «правильной» ДНК. У дрожжей такая вспомогательная геликаза охарактеризована и названа белком Dna2.

После удаления инициаторной РНК (ДНК) комплекс Polδ /PCNA продолжает синтезировать дочернюю цепь ДНК до тех пор, пока не натолкнется на 5^/-конец сформированный Fen1. После этого ДНК-лигаза I соединяет вместе две цепи ДНК.