Почвенных микроорганизмов

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОСТАВА

И АКТИВНОСТИ

ПОЧВЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

Мир почвенных микроорганизмов весьма разнообразен, однако здесь в основном будут рассмотрены бактерии, микроскопические грибы, актиномицеты и близкие к ним существа. Эти организмы обычно изучаются в курсах микробиологии.

Прежде всего встает вопрос об общем количественном анализе микроорганизмов почвы. Наиболее объективный метод такого анализа — прямое микроскопирование почвы, принцип которого был предложен С. Н. Виноградским. При этом методе готовят почвенную суспензию и под микроскопом в определенном ее объеме подсчитывают общее число микроорганизмов. При подго­товке почвенной суспензии целесообразно использовать один из рекомендуемых способов диспергирования почвы и десорбции микроорганизмов из почвенных частиц: растирание почвы, обра­ботка поверхностно-активными веществами, ультразвуком и т. д. Пересчетом можно установить, сколько микроорганизмов прихо­дится на 1 г исследуемой почвы. С. Н. Виноградский готовил препараты на предметном стекле и просматривал их под оптиче­ским микроскопом. В поле зрения можно было видеть палочко­видные бактерии, мелкие и крупные кокки, обрывки мицелия грибов и актиномицетов и другие микроорганизмы.

Определение числа бактериальных клеток прямым микроско-пированием облегчается при использовании люминесцентного микроскопа, красителей микробных клеток. При этом микроорга­низмы лучше видны среди мелких частиц почвы. В качестве кра­сителей применяют акридиновый оранжевый, изотиоционат и другие вещества.

При окрашивании акридиновым оранжевым красный тон при­обретают мертвые клетки, зеленый — живые. Для окраски гриб­ного мицелия и установления его длины при прямом микроскопи-ровании пользуются диацетатом флуоресцеина.

Иногда прямую микроскопию применяют для микробиологи­ческого анализа срезов почвы, помещенных в метилметакрилат, фильтратов почвенных суспензий на фильтрах Зейца, окрашен­ных дианиловым голубым или метиленовым синим и т. д.

Б. В. Перфильев и Д. Р. Габе для подсчета микроорганизмов в почве рекомендовали пользоваться сконструированной ими ка­пиллярной камерой, глубина которой не превышает 30—40 мкм, а ширина не более поля зрения микроскопа. Подсчитав число микро­организмов в капилляре, можно затем сделать пересчет на 1 г почвы.

Д. И. Никитин использовал для прямого подсчета микроорга­низмов почвы электронный микроскоп. С его помощью наряду с обычными микроорганизмами можно_£ -обнаружить множество мельчайших форм микроскопических существ. Сейчас для прямого анализа микрофлоры почвы начинают применять сканирующий электронный микроскоп, дающий объемное изображение анали­зируемых объектов (рис. 52).

Прямые методы дают представление об общем количестве микроорганизмов в почве. Однако внешний облик микроорганиз­мов не позволяет судить об их функциях, поэтому необходимо дополнительно определить принадлежность микроскопических су­ществ, обнаруженных в почве, к разным систематическим и физиологическим группам.

Состав отдельных групп микроорганизмов (бактерии, актино-мицеты, грибы и т. д.) может быть уточнен посевом почвенной суспензии на разные по составу твердые питательные среды, на которых затем развиваются зародыши тех или иных групп микро­организмов. В практике обычно используют агаризованные или желатинизированные, а иногда силикогелевые питательные среды.

После инкубации засеянных чашек в термостате подсчитывают выросшие на твердой питательной среде колонии. Допуская, что каждая колония произошла из одного зародыша того или иного микроорганизма, устанавливают число клеток во взятом образце почвы. Подобный пересчет имеет ряд условностей. Например, бак­териальные колонии могут вырасти на питательной среде не из одной клетки, а из группы их, оставшихся неразделенными в почвенной взвеси. Колонии грибов и актиномицетов вырастают из обрывков мицелия разной величины и из спор. Дифференци­ровать колонии, образованные из спор и из мицелия этих микро­организмов, невозможно. Поэтому правильнее богатство почв мицелиальными микроорганизмами учитывать, измеряя длину их мицелия при прямом микроскопировании.

Представляют значительный интерес примерные соотношения числа микроорганизмов, подсчитываемых в одной и той же почве различными методами. В таблице 7 приведены соответствующие данные Д. И. Никитина для дерново-подзолистых почв Подмо­сковья.

Как видно, прямая микроскопия дает показатели, во много раз превосходящие те, которые получены методом посева. Это объясняется прежде всего тем, что при прямом анализе подсчи­тывают живые и мертвые клетки. Число последних может быть велико, так как индивидуальная жизнь микроорганизмов очень

коротка. Однако численность мертвых микробов в почве обычно не превышает 25% их общего числа.

Общие показатели численности микробов, как бы условны они ни были, представляют интерес. На их основании можно при­мерно вычислить массу совокупности микроорганизмов в почве. Как показывают подсчеты, она составляет десятые доли процента массы почвы. По мере перехода от северных почв к южным про­цент микробной массы в них увеличивается.

В последнее время для установления микробной массы почвы применяют косвенный метод, рекомендованный Д. Дженкинсоном. Почву обрабатывают летучим антисептическим веществом, убиваю­щим микробов. После дефумигации почвы определяют количество выделяемой углекислоты, которая в основном образуется из от­мерших клеток. Затем расчетным путем можно примерно уста­новить массу органического вещества микробов.

Предложены и другие косвенные методы определения в почве массы отдельных групп микроорганизмов — для бактерий по спе­цифической для прокариот мурамовой кислоте, для грибов — по хитину, входящему в состав их клеток, для водорослей — по коли­честву хлорофилла и т. д. Почвенную биомассу можно примерно измерять по компонентам микробной клетки — АТФ и ДНК, но более точным биохимическим методом считают ее установление по содержанию аденозина и аденина при помощи флуорометрии.

В последнее время сотрудники Л\ГУ предложили оригиналь­ный «регидрационный метод». Почву подсушивают при темпера­туре не выше 70°С, что нарушает барьер проницаемости микроб­ных клеток, и в водную или солевую вытяжку, -переходит часть внутренних компонентов клетки. Их концентрация может быть измерена с использованием определенного коэффициента и уста- ' новлена биомасса микроорганизмов в почве.

По обобщенным данным Д. Г. Звягинцева, сырая масса бакте­рий в пахотном слое различных почв колеблется от 0, 5 до 15 т/га, микроскопических грибов — от 5 до 20 т/га.

В связи с тем что при микроскопическом исследовании почв отдельные показатели являются условными, надежнее использо­вать одновременно несколько методов.

При анализе почв нередко учитывают число отдельных физио­логических групп микроорганизмов. Это делают так называемым методом титра, при котором твердые или жидкие избирательные (элективные) питательные среды для определенных групп микро­организмов заражают разными разведениями почвенной суспен­зии. Устанавливая после выдерживания в термостате степень разведения, показавшего наличие искомой группы микроорга­низмов, можно простым пересчетом определить численность ее представителей в почве. Таким путем узнают, насколько богата почва нитрификаторами, денитрификаторами, целлюлозоразлагаю-щими и другими микроорганизмами.

Метод титра используют при учете почвенных водорослей и простейших. Для водорослей берут минеральные среды, которые после заражения рядом разведений почвенной суспензии выдер­живают при искусственном освещении. При учете простейших, используя также разведения почвенной суспензии, инфицируют среды, содержащие микроорганизмы, которыми простейшие могут питаться.

Для характеристики типа почвы и ее состояния важны не только показатели численности разных групп микроорганизмов, но и анализ состояния в почве отдельных их родов и видов. За редким исключением, физиологические группы микроорганизмов очень разнообразны. Внешняя обстановка может резко менять видовой состав почвенных микроорганизмов, но почти не отра­жается на числе их физиологических групп. Поэтому при анализе почвы важно стремиться установить состояние отдельных видов микроорганизмов.

Совершенно очевидно, что диагностика до вида, даже всех обычных сапрофитов почвы, невозможна. Поэтому сейчас стре­мятся выявить микроорганизмы, характерные для определенных почв. Список подобных индикаторных микроорганиз­мов пока не столь велик, но он будет возрастать по мере раз­вития почвенной микробиологии. Однако уже в настоящее время определение индикаторных микроорганизмов помогает установить тип почвы, ее окультуренность и характер воздействия на почву агротехнических и агрохимических приемов.

Приведенные методы анализа позволяют определить числен­ность микробов или отдельных их групп в почве, но не показывают их состояния (распределения, взаимосвязей и т. д.). Для выясне­ния этого вопроса существует ряд подходов. Так, в 30-х годах текущего столетия академик АН УССР Н. Г. Холодный рекомен­довал изучать микробные пейзажи почвы с помощью «стекол обрастания». При работе по этому методу в почву закладывают предметные стекла и оставляют там на определенный срок. Поверхность стекол обрастает микрофлорой, характерной для данной почвы. Микроскопический анализ стекол позволяет полу­чить представление как о составе, так и о взаимоотношениях микроорганизмов в почве.

Новые возможности в области изучения микробных пейзажей почвы открывает капиллярный метод Б. В. Перфильева и Д. Р. Габе. Для изучения группового состава микроорганизмов почв ими сконструирован капиллярный прибор — педоскоп, кото­рый может быть использован и для работы с грунтами. Педоскоп представляет собой набор капиллярных ячеек с 5—6 прямоуголь­ными каналами. Ячейки закладывают в пазы широкого стеклян­ного держателя (рис. 53) и заполняют полужидкой агаризованной средой, содержащей в качестве органического субстрата гумусо­вые вещества (фульвокислоты). Это создает для микроорганиз­мов условия, близкие к почвенным. Педоскоп выдерживают в почве 1, 5—2 месяца, затем просматривают его под микроскопом. С помощью этого метода удается выявить характерные для почвы микробные ассоциации.

Рис. 53. Педоскоп с различными типами капиллярных ячеек (по Б. В. Перфильеву и Д. Р. Габе).

Важно установить не только состав микронаселения почвы, но и ее суммарную биохимическую активность. Одним из пока­зателей такой активности служит нитрификационная способность почвы, характеризующая мобилизуемость азотного запаса почвы в результате деятельности микроорганизмов. Нитрификационную способность устанавливают по нарастанию в почве количества нитратов после выдерживания ее при определенных условиях в термостате. Описанная проба свидетельствует о потенциальной способности почвы накапливать то или иное количество минераль­ного азота. В ряде случаев этот показатель важен для практики.

Если в начале опыта в почву внести соль аммония, то по накоплению нитратов можно получить дополнительное представ­ление об энергии работы нитрифицирующих бактерий.

При изучении почвенной биодинамики определяют выделение почвой СО₂ («дыхание» почвы). Данная проба показывает в ос­новном энергию процесса разложения в почве органических сое­динений.

Можно установить быстроту распада в почве любого химиче­ского вещества путем учета продуктов распада или убыли внесен­ного в почву соединения. Для этого в почву помещают полосы бумаги или лучше льняной ткани, закрепленной на стекле, —метод «аппликаций». Периодически тесты извлекают из почвы, просма­тривают и фиксируют зоны распада материала (рис. 54).

Метод аппликаций весьма показателен при решении некото­рых агрономических задач. С его помощью, например, можно выявить интенсивность процессов в разных горизонтах пахотного слоя, установить действие различных удобрений, мелиорирующих средств и т. д.

Для оценки активности почвы могут быть использованы и ферментные показатели. Ферменты, находящиеся в почве, в основ­ном продуцируются микроорганизмами. Поэтому между фермен-

тативными показателями почвы и определенными микробиологи­ческими процессами намечается коррелятивная зависимость. Подобная связь устанавливается, например, между активностью инвертазы и интенсивностью дыхания почвы, активностью окси-дазы И динамикой нитратов. Абсолютное значение отдельных фер­ментных показателей, по данным А. Ш. Галстяна, Т. А. Щерба­ковой, Ф. X. Хазиева и других ученых, различно у почв разных климатических зон, что может быть использовано в диагностиче­ских целях.

Следует отметить, что при отмирании микроорганизмов окру­жающая среда еще более обогащается ферментами, которые в значительной части адсорбируются почвенными коллоидами, что способствует их стабилизации. Наши исследования показали, что ферментные процессы в почве прекращаются при значительно более низкой влажности, чем деятельность микроорганизмов. Сле­довательно, биохимические процессы могут протекать даже в от­носительно сухих почвах. Определение активности ферментов почвы, как показано А. Ш. Галстяном, может дать представле­ние об их плодородии.

В приведенном обзоре указаны лишь основные подходы к выявлению состава и активности почвенных микроорганизмов.

Рис. 54. Распад льняной ткани в черноземе: а, б, в — в течение 1, 2 и 3 месяцев соответственно.

Ткани в черноземе: а, б, в-в течение 1, 2, и 3 месяцев соответственно.

В зависимости от теоретических или практических задач, стоящих перед почвенными микробиологами, следует пользоваться различ­ными комплексами методов анализа почвы *.