Схема проведення експерименту

Перед початком експерименту щури були поділені на 4 групи по 5 тварин в кожній: І гр. - контроль 5 діб, ІІ гр. - контроль 14 діб, ІІІ гр. цефтріаксон 5 діб, IV - цефтріаксон 14 діб. Цефтріаксон вводили внутрішньом'язево одноразово в дозі 50 мг/кг. Щурам ІІІ гр. цефтріаксон вводили з 1-го по 5-й день, аутопсія на 6-й день. Відповідно контрольна група (І) отримувала 0, 2 мл дист. води внутрішньом'язево з 1-ого по 5-й день, аутопсія на 6-й день. Щурам IV групи вводили цефтріаксон з 1-ого по 14-й день включно, аутопсія на 15-й день. Відповідно контрольна група отримувала ін'єкцію води. В кінці експерименту щурів умертвляли інгаляцією CO2 з наступною цервікальною дислокацією.

3.4. Моніторинг клінічних параметрів стану щурів

Моніторинг клінічних параметрів стану щурів, які визначались за масою тіла, млявістю (0 - 3 бали: 0 - норма, 1 - помірно піднята шерсть, 2 - тварина брудна, зменшення спонтанних рухів, 3 - тварина майже не рухається, не реагує на інших тварин), діареєю (0 - 3 бали: 0 - норма, 1 - м'які чи водянисті випорожнення, волога пляма навколо ануса до 1 см² , охоплює нижню частину живота, 3 - пляма до грудної клітки), оцінювали щоденно.

3.5. Отримання гомогенату слизової оболонки

Після декапітації видаляли товсту кишку, розрізали в повздовжньому напрямку, вивертали слизовою назовні та ретельно промивали. Далі обережно відділяли слизовий шар товстої кишки та гомогенізували у 0, 9 %-у розчині NaCl при Т = +4º С з використанням DOUNCЕ гомогенізатора (Sigma-Aldrich).

Отриманий гомогенат слизової оболонки товстої кишки фільтрували крізь чотири шари нейлонової сітки та використовували для проведення експериментальних досліджень

3.6. Визначення концентрації протеїнів методом Лоурі

Метод базується на утворенні забарвлених продуктів ароматичних амінокислот з реактивом Фоліну у поєднанні з біуретовою реакцією на пептидні зв’язки. В дослідну пробірку наливали 400 мкл проби та 2 мл реактиву С: 10 мл реактиву А (2 г Na₂CO₃ + 400 мг NaOH на 100 мл dist H₂O) + 200 мкл реактиву В (500 мг CuSO₄*5Н₂O + 1 г Na₃C₆H₅O₇*2Н₂O на 100 мл).

В контрольну пробу замість досліджуваного білкового матеріалу додавали 400 мкл dist H₂O. Через 10 хвилин в пробірки додавали 200 мкл реактиву Фоліна і залишали ще на 30 хвилин для розвитку забарвлення, його інтенсивність вимірювали на спектрофотометрі при l=750 нм. Кількість мікрограм білку визначали за допомогою калібрувального графіку.

3.7.1. Визначення дієнових кон’югатів ненасичених жирних кислот

У щільно притертий скляний гомогенізатор Поттера поміщали аліквоту, що містила 0, 1 мг протеїну досліджуваного зразка, додавали 5 мл суміші гептан/ізопропіловий спирт у співвідношенні 1: 1 та гомогенізували 10 хв. Проби центрифугували (1000 g, 15 хв) у пробірках з притертою пробкою.

Відбирали надосадову рідину та додавали до неї 0, 5 мл дистильованої води для розшарування фаз гептану та ізопропілового спирту. Верхню гептанову фазу відбирали для визначення вмісту шиффових основ на флуорометрі RF-510, (Shimadzu, Японія) за умов λ _збуд =360 нм і λ _еміс =420 нм. Для визначення дієнових кон’югатів у хімічні пробірки відбирали по 0, 3 мл гептанової фази, додавали 1, 5 мл 96% етилового спирту, проби перемішували, вимірювали поглинання при λ =233 нм на спектрофотометрі-46 (ЛОМО, Росія). Вміст дієнових кон’югатів у пробі розраховували з величини молярного коефіцієнта екстинції при 233 нм для спряжених дієнів поліненасичених жирних вищих кислот, ε = 1, 56 х 10⁵ см^-1х М^-1 на мг протеїну [23].

3.7.2. Визначення вмісту ТБК-активних продуктів

Вміст ТБК-активних продуктів оцінювали згідно методу Стальної. Аліквоту клітинної суспензії, що містила 0, 5 мг білку доводили до загального об'єму 0, 5 мл буфером (мМ): KCl - 175, трис-HCl - 25, рН=7, 4, об’єм проби становив 0, 5 мл. Після цього відразу додавали 0, 2 мл 20% трихлороцтової кислоти (ТХО). Денатурований протеїн осаджували центрифугуванням (1000 g, 15 хв). До 0, 5 мл отриманого супернатанту додавали додавали 0, 25 мл 0, 8% тіобарбітурової кислоти (ТБК), суміш інкубували на киплячий водяній бані 10 хв для розвитку забарвлення. Визначення забарвлення проводили на спектрофотометрі (СФ-46, ЛОМО, Росія) при l=532 нм.

Вміст ТБК-активних продуктів на 1 мг білка розраховували на основі значення молярного коефіцієнта екстинкції комплекса малонового діальдегіду з 2-тіобарбітуровою кислотою: ε = 1, 56 х 10⁵ см^-1х М^-1 [24].

3.7.3. Визначення активності каталази.

Каталаза (Пероксид водню: пероксид водню-оксидоредуктаза) [КФ 1.11.1.6]. Принцип методу полягає в тому, що каталаза руйнує субстрат Н2О2, незруйнована частина пероксиду водню при взаємодії з солями молібдену утворює стійкий забарвлений комплекс.

У пробірки вносили 2 мл 0, 03 % розчину пероксиду водню. Реакцію починали додаючи 0, 1 мл гомогенату (0, 1 мг білка) до необхідної концетнрації доводили за допомогою H2O дист. У холосту пробу додавали 0, 1 мл дистильованої води. Проби витримували при кімнатній температурі 10 хв, реакцію зупиняли додаванням 1 мл 4 %-го розчину молібдату амонію. Інтенсивність забарвлення вимірювали на спектрофотометрі-46 при l=410 нм проти контрольної проби, у яку замість пероксиду водню додавали 2 мл Н2О.

Активність каталази розраховували за формулою:

_Е= (А_хол - А_досл) _,

K х t х а

де Е – активність каталази, Ахол і Адос - екстинція холостої та дослідної проб, K – коефіцієнт мілімолярної екстинкції перекису водню, що дорівнює 22, 2 х 103 мМ-1 х см-1, t – час інкубації 10 хв., а – вміст білку в пробі, мг. Активність визначали у нМоль Н2О2/ хв * 1 мг білка.

3.7.4. Визначення активності СОД

Розчин АА (акриламід, 30 %-й розчин; біс-акриламід, 0, 8 %-й розчин), електро­дний буфер (тріс, 25 мМ; гліцин, 250 мМ), буферний розчин Б (гліцерол, 30 %-й розчин; бромфеноловий синій 0, 0025 %-й розчин; тріс 63 мМ; рН 6, 8), 0, 25 %-ий розчин тріс, рН 6, 8, 0, 75%-ий розчин трис, рН 8, 8, ТЕМЕD, 10 %-й розчин персульфату амонію, етиловий спирт. Буфер П (20 мМ Na₂РО₄ і 20 мМ К₂НРО₄, рН 7, 8), 2, 5 мМ розчин тетразолію нітро-синього в буфері П, буфер П з 28 мкМ ТЕМЕD і 28 мкМ рибофлавіну.

Гомогенат слизової оболонки ТК, отриманий згідно опису в підрозділі 3.5., центрифугували 10 хв при 3000g. Супернатант змішували із буфером Б для завантаження в гель.

Поліакриламідний. гель готували без додавання ДСН. У пробірках змішували компоненти для приготування верхнього та нижнього гелів, як наведено в таблиці. Каталізатор полімеризації TEMED додавади тільки безпосередньо перед заливкою у касети.

Таблиця 3.1.

Склад ПААГ

Спочатку у касети заливали суміш для нижнього гелю, для цього після додавання TEMED розчин набирали у шприц, намагаючись уникнути бульбашок повітря і акуратно заповнювали касету, залишаючи відстань 5 мм до дна лунок, зверху майбутній гель покривали шаром етилового спирту завтовшки 2-3 мм та залишали для полімеризації на 20-30 хв Після завершення полімеризації нижнього гелю, в чому пересвідчувалися злегка нахиляючи касету, видаляли етиловий спирт та ретельно промивали гель водою після чого осушували фільтрувальним папером. Компоненти верхнього гелю заливали до краю касети і відразу ж вкладали пластикову гребінку. Полімеризація верхнього гелю тривала 10-15 хв. Дуже обережно, намагаючись не пошкодити лунки виймали гребінку та промивали лунки ТРІС - гліциновим буфером, касету закріплювали у електрофоретичній камері та заповнювали систему електродним буфером. Досліджувані зразки завантажували у лунки мікрошприцом із розрахунку 10 мкг загального протеїну.

Електрофоретичне розділення протеїнів по молекулярній масі здійснювали при силі струму 30mA. Електрофоретичне розділення звичайно тривало 50-90 хв. Процес контролювали спостерігаючи за рухом у гелі фронту барвника бромфенолового блакитного, який рухається попереду усіх білків. Момент виходу фронту бромфенолового блакитного з геля в електродний буфер вважався завершенням електрофорезу. Після закінчення касети відкривали і відділяли нижній гель.

Гель інкубували у 2, 5 мМ розчині нітросинього тетразолію в буфері П при Т=20 ^оС впродовж 30 хв, після.чого гель переносять в інший контейнер, що містить 28 мкМ ТЕМЕD, 28 мкМ рибофлавіну та інкубували ще протягом 20 хв. Гель двічі промивали у буфері П і залишали під інтенсивним освітленням.

Під час проявлення гель набуває мутного забарвлення за винятком ділянок з активними супероксиддисмутазами, різні типи яких розрізняють за їхнім положенням у гелі. Розмір прозорої ділянки гелю залежатиме від активності супероксаддисмутаз. Гель фотографували у волого­му стані та проводили оптико-денситометричний аналіз плям, використо­вуючи спеціалізоване програмне забезпечення [26].