Методические указания к практической работе

Методическая разработка практического занятия для учащихся отделения «Медико-диагностическое дело» по дисциплине

Микробиология с микробиологическими исследованиями».

Тема занятия: «Бактериологическая диагностика

стрептококковых инфекций»

Составила преподаватель Якимова Л.М.

Минск

Тема: «Бактериологическая диагностика стрептококковых инфекций»

Цель занятия: Дать понятие о правилах забора, хранения и транспортировке исследуемого материала при стрептококковых инфекциях, питательных средах, необходимых для выделения и идентификации стрептококков и научить их готовить. Обучить методике микробиологической диагностики стрептококковых инфекций.

Самостоятельная работа:

1. Взятие слизистого отделяемого из зева стерильным тампоном и посев на КА.

2. Изучение характера роста культуры на КА, отбор подозрительных колоний

3. Приготовление мазков, окраска по Граму, микроскопирование.

4. Отсев подозрительных колоний на сахарный бульон для накопления чистой культуры.

5. Определение чувствительности к бацитрацину, оптохину, постановка теста с желчью.

Методические указания к практической работе

Исследование на стрептококки проводят с диагностической целью и по эпидпоказаниям. Идентификация стрептококков до вида сложна, но обязательна при скарлатине и вспышках стрептококковых инфекций в родильных домах. В остальных случаях достаточно определить серогруппу. Исследуемым материалом при стрептококковых инфекциях являются: слизистое отделяемое из зева, миндалин, влагалища, смывы с кожи, сосков молочных желез, гной, мокрота, кровь, СМЖ, отделяемое ран, ушей и др.

1 этап. Биологический материал засевают на кровяной агар. При этом тщательно наносят его на 1/6 поверхности (приблизительно 2× 3 см) около края чашки с кровяным агаром. Затем стерильной петлей материал штрихом разносится через первый участок примерно на 1/4 поверхности чашки Петри, чашку поворачивают на 90º и стерильной петлей производят посев штрихом через участок вторичной инокуляции на третий квадрант. Чашку вновь поворачивают на 90º и стерильной петлей рассевают материал с третьего квадранта на четвертый, последними несколькими штрихами, не возвращаясь к третьему квадранту. Используют 3-4 серии штрихов для получения отдельных колоний. Следует сделать проколы вглубь агара в нескольких местах (как в засеянных, так и незасеянных участках чашки) без прожигания петли. Рост в толще кровяного агара сопровождается максимально выраженной гемолитической реакцией.

2 этап. Идентификация стрептококков начинается с изучения колоний в первичных посевах материала на чашках с кровяным агаром.

Streptococcus pyogenes может давать разные типы колоний: слизистые (мукоидные) - прозрачные, правильной круглой формы, напоминающие капельки росы, диаметром 0, 5-2, 0 мм, матовые (шероховатые) - круглые колонии серовато-белого цвета диаметром 0, 5-2 мм с характерным слегка приподнятым центром. Слабовирулентные или авирулентные штаммы S. pyogenes, а также S. agalactiae и некоторые штаммы энтерококков дают гладкие мелкие сферической формы колонии с ровным краем и блестящей влажной поверхностью, диаметром до 1 мм. Для S. pyogenes, S. agalactiae характерен β –гемолиз - полный лизис окружающих колонию эритроцитов (полное просветление среды), шириной от десятых долей до нескольких миллиметров, в зоне гемолиза вокруг колоний и местах проколов петлей эритроциты отсутствуют полностью. Колонии пневмококка на кровяном агаре полупрозрачные, плоские с приподнятым краем и блюдцеобразным центром влажной «сметанообразной» консистенции, вокруг колоний зеленящая зона гемолиза (ά –гемолиз - частичный лизис окружающих колонию эритроцитов, вызывающий зеленовато-серое или коричневое окрашивание среды; ά –прим гемолиз – узкая зона интактных эритроцитов, непосредственно прилегающих к колонии с зоной полного гемолиза, окружающей зону интактных эритроцитов. Этот тип гемолиза иногда принимают за β –гемолиз. Он также называется «широко-зонный ά –гемолиз») При длительной инкубации (48 часов) центральная часть колоний может опускаться, что объясняется действием пневмококковых аутолизинов. Колонии некоторых штаммов пневмококков могут полностью уплощаться, образуя поверхность «шляпки гвоздя». R-формы образуют сферические колонии с неровными краями. Колонии пневмококков иногда серовато - мутные, слизистые, до 2 мм в диаметре, склонные к слиянию между собой. При просмотре в стереомикроскопе (в проходящем свете) в зоне гемолиза вокруг колоний пневмококков и местах проколов петлей видны редкие или даже единичные эритроциты.

Из подозрительных колоний готовят мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. В препаратах стрептококки располагаются парами, короткими цепочками, иногда образуют скопления, напоминающие гроздья стафилококков. Морфологические свойства стрептококков, особенно в первых генерациях, характеризуются выраженным полиморфизмом. Наряду с шарообразными формами в мазках содержатся вытянутые в длину грубые кокки разной величины, даже в пределах одной цепочки. Пневмококки представляют собой ланцетовидные диплококки с заостренными наружными концами, иногда располагаются в виде цепочки. При использовании специальных методов окраски у пневмококков выявляют капсулу, окружающую пару или несколько пар кокков. Из подозрительных колоний ставят тест на каталазу. Стрептококки дают отрицательную каталазную реакцию (не обладают ферментом каталаза).

При обнаружении стрептококков в препарате оставшийся от микроскопического исследования материал колоний снимают петлей и инокулируют в питательный бульон с сывороткой крупного рогатого скота (10%) или глюкозы (0, 2%), или в питательный бульон для стрептококков и высевают на сектор кровяного агара, на который накладывают диск, содержащий 0, 04 ЕД бацитрацина и диск с котримаксозолом, содержащий 23, 75 мкг сульфаметоксазола и 1, 25 мкг триметаприма. Инкубируют при 35-37⁰ С, 5-10% СО₂.На жидких питательных средах рост различных видов стрептококков имеет свои особенности. Характер роста определяется длиной цепочек: придонно-пристеночный рост, с образованием мелкозернистого осадка, с сохранением полной прозрачности среды (S. pyogenes); придонный рост в виде пушистого рыхлого осадка с сохранением прозрачности и равномерным более или менее интенсивным помутнением надосадочного слоя (S.pneumoniae); диффузный рост с интенсивным помутнением бульона и образованием небольшого гомогенного осадка (Е. faecalis, Е. faecium, некоторые штаммы S.pyogenes и S.agalactiae).

Результат бактериологического обследования, ограничивающийся только выделением β -гемолитических стрептококков недостаточен для постановки этиологического диагноза. Необходимо определение серогрупповой и видовой принадлежности. Серогруппирование опеределяют с помощью реакции преципитации, используя специфические антисыворотки, или с помощью слайд-агглютинации.

Большая часть стрептококков, выделенных от человека, относится к группам А, В, С, D и G. Наибольшее значение в этиологии стрептококковых инфекций имеют стрептококки группы А (S. pyogenes), группы В (S. agalactiae) и пневмококки (S. pneumoniae).

Идентификацию S. рyogenes (группа А) производят по: 1) чувствительности к бацитрацину, для чего производят посев одной или нескольких колоний β -гемолитического стрептококка штрихом на сектор кровяного агара и помещают диски с бацитрацином 0, 04 МЕ на засеянную поверхность и инкубируют 18-24 часа при 35-37⁰ С в атмосфере 5-10 % СО₂.Зона ингибирования роста стрептококков вокруг диска с бацитрацином позволяет отнести штамм: к β -гемолитическим стрептококкам, предположительно из серогруппы А. Стрептококки групп C и G так же чувствительны к бацитрацину. 2) PYR – тесту, для чего с помощью пинцета диск, импрегнированный PY, переносят на стерильную чашку Петри, увлажняют его стерильной водой, избегая попадания избытка воды. С помощью стерильной палочки переносят несколько колоний с кровяного агара на поверхность диска и ждут 2 минуты, добавляют одну каплю реагента и наблюдают за изменением цвета. Положительная реакция - появление красного окрашивания в течение 1 минуты (фермент пирролидонилпептидаза имеется только у S.pyogenes). Отрицательная реакция – слаборозовое окрашивание или отсутствие изменения цвета. 3) Серологическая идентификация S.pyogenes основана на выявлении группового полисахарида клеточной стенки. Реакция взаимодействия антигена с антителом учитывается по видимой агглютинации либо по другим изменениям в зависимости от конкретной тест-системы.

Точная идентификация S.pyogenes требует проведения как минимум двух подтверждающих тестов при выделении β – гемолитических, каталазоотрицательных, грамположительных кокков, располагающихся в мазке парами и цепочками - определение чувствительности к бацитрацину, выявление группового антигена А или PYR – тест.

Идентификация S. agalactiae (группа В) производится по: 1) CAMP – тесту, для чего через центр чашки с кровяным агаром сплошной линией наносят суточную бульонную культуру β – гемолитического S.aureus. Испытуемые штаммы суточной бульонной культуры стрептококка наносят отдельными штрихами параллельными друг другу и перпендикулярными по отношению к линии посева стафилококка не доходя до нее 2мм. На одну чашку высевают не более четырех штаммов стрептококка. Реакцию учитывают через 18-24 часа культивирования при 35-37⁰ С. Положительный результат – образование «клина» гемолиза между посевами стрептококка и стафилококка («бабочка», «трапеция»). В качестве контрольных используют штаммы S.agalactiae (положительный контроль) и отрицательный контроль - S.pyogenes; 2) гидролизу гиппурата натрия, для чего петлю культуры суспендируют в 0, 4 мл 1% водного раствора гиппурата натрия. Через 2 часа инкубации при 35-37 вносят 0.2 мл раствора нингидрина (3.5 г нингидрина в 100 мл смеси ацетона и бутанола в равном соотношении) и инкубируют 10 мин. Появление сине-пупрпурного окрашивания свидетельствует о положительной реакции и принадлежности к группе В; 3) сероидентификации S.agalactiae, основанной на выявлении группового полисахарида клеточной стенки, которая выполняется аналогично идентификации S.pyogenes.Точная идентификация S.agalactiae также требует проведения как минимум двух подтверждающих тестов.