Методические указания

Реакция преципитации (РП), как и реакция агглютинации, принадлежит к разряду серологических реакций осадочного типа, но в отличие от РА в ней используют не корпускулярные, а растворимые антигены микроорганизмов. Образование комплек­сов антиген — антитело сопровождается изменением оптической плотности среды (помутнением) — преципитацией (от лат. praecipitatio — падение вниз), что расценивают как положитель­ный результат реакции.

Антиген для РП готовят из чистых культур микроорганизмов, если антиген предназначен для серодиагностики, или из ткане­вого материала, содержащего микроорганизмы, если РП ставят, чтобы при помощи известной иммунной сыворотки обнаружить возбудитель в патологическом материале.

Физические методы экстрагирования антигенов основаны на механическом разрушении микробных клеток посредством рас­тирания с кварцевым песком, встряхивания на шюттель-аппарате в колбе со стеклянными шариками, многократного заморажи­вания и оттаивания или воздействия ультразвуком. Полисахаридные термостойкие антигены выделяют термической обработкой (кипячением, автоклавированием).

Из химических методов получения антигенов достаточно ши­роко используют экстрагирование трихлоруксусной кислотой (полный антиген Буавена); кислотный или щелочной термогид­ролиз—прогревание материала, например, в 1%-м растворе ук­сусной кислоты или 0, 1 н. растворе гидроксида натрия; экстраги­рование при помощи ацетона, мочевины, этилового спирта, эфира и других растворителей; часто применяют различные детергенты — дезоксихолат натрия, лаурилсульфат натрия и т.д.; используют методы ферментативного разрушения микробных клеток, например, посредством воздействия трипсином.

Выбор того или иного способа выделения растворимого анти­гена зависит от его химической природы. Главное требование к любому из методов — эффективное извлечение антигена без его денатурации.

На основе феномена преципитации разработаны реакция кольцепреципитации (РКП), реакция диффузионной преципита­ции (РДП), радиальной иммунодиффузии; принцип реакциипреципитации использован в иммуноэлектрофорезе и встречном имщноэлектрофорезе.

Реакция кольцепреципитации (РКП). Известна по имени автора как реакция Асколи (1911); разработана для диагностики сибирс­кой язвы. РКП используют в ветеринарной диагностической практике преимущественно для выявления микробных антиге­нов в тканевом материале. Обязательное условие постановки РКП — прозрачность раствора антигена и иммунной сыворотки, поэтому при необходимости компоненты реакции освобождают от взвешенных частиц фильтрованием, например, через асбесто­вую вату.

Техника постановки РКП включает в себя три варианта.

Метод «наслаивания» антигена. В уленгутовские пробирки (диаметр 2...3 мм) вносят пастеровской пипеткой с тонким ка­пилляром, не смачивая стенок пробирки, 0, 3...0, 4 мл иммунной преципитирующей сыворотки. Затем по стенке пробирки осто­рожно наслаивают на поверхность сыворотки 0, 1...0, 2 мл раство­римого исследуемого антигена (преципитиногена). Смешивания компонентов не происходит благодаря различию плотности сы­воротки и экстракта.

Учет результатов проводят на фоне темной бумаги. Через 1...2мин в зоне взаимной диффузии антигена и антител, на гра­нице контакта компонентов, происходит помутнение среды, ви­димое сбоку как серо-белый диск (преципитат).

Метод «подслайвания» антител. В пробирку вначале вносят антиген, а затем осторожно при помощи пастеровской пипетки на дно пробирки, под антиген, «подслаивают» иммунную сыво­ротку.

При постановке кольцевой РП в ходе исследования тканевого материала необходимы следующие контроли: 1) иммунная сыво­ротка + стандартный антиген; 2) иммунная сыворотка + физио­логический раствор; 3) иммунная сыворотка + экстракт из тка­ней здоровых животных.

Показания РП считают достоверными, если в первом контро­ле получают положительный, а в остальных — отрицательный ре­зультат (рис. 61).

Микровариант РКП. Разработан для экономии компонен­тов. В этом случае используют стеклянные капилляры или тонко оттянутые кончики пастеровских пипеток диаметром 0, 5... 1 мм. Капилляр опускают одним концом во флакон с пре­ципитирующей сывороткой, набирают ее на высоту 1...1, 5 см, закрывают верхнее отверстие капилляра указательным паль­цем. Затем ватой удаляют излишек сыворотки с наружной сто­роны капилляра, погружают его в раствор антигена и набира­ют равное количество антигена. Капилляр переворачивают с таким расчетом, чтобы смесь сыворотки и антигена оказалась в середине капилляра, после чего закрепляют вертикально в пластилиновой пластинке. Результаты учитывают, как и при обычной РКП.

Реакция диффузионной преципитации (РДП). Основана на встречной диффузии антител (иммунной сыворотки) и раствори­мых антигенов в агаровом геле (двойная диффузия). Если анти­ген состоит из смеси моноантигенов, то каждый из них диффун­дирует с различной скоростью и точки эквивалентных соотноше­ний каждого антигена и гомологичных антител будут находиться в различных участках агарового геля, где и формируется преци­питат в виде линий. Таким образом, каждая пара антиген — ан­титело образует свою линию преципитации. При помощи РДП можно анализировать сложные антигенные смеси, поскольку каждый антиген дает свою линию преципитации. В ряде случаев РДП используют как метод серологической диагностики инфек­ционных болезней.

Из очищенного агара фирмы «Дифко» готовят 1, 5%-й раствор агара в физиологическом растворе (рН 7, 2...7, 4) с добавлением мертиолата (конечное разведение 1: 10 000) как консерванта.

На хорошо обезжиренное стекло, лежащее строго горизон­тально, наливают расплавленный агар в количестве, достаточном для формирования слоя геля толщиной 3...4 мм. Затем штампами вырезают лунки в агаровом геле; агар из лунки удаляют с помо­щью трубочек. На дно лунки вносят каплю горячего агара с пос­ледующим его удалением, что создает «дно» лунки и предотвра­щает подтекание компонентов под гель.

В зависимости от конкретной задачи применяют штампы с различным количеством пробойников, обеспечивающие полу­чение лунок разного диаметра и на разном расстоянии. При изучении неизвестных реагентов оптимальное расстояние меж­ду лунками необходимо установить в предварительных опытах. В зависимости от конкретной задачи в центральную лунку вно­сят иммунную сыворотку, в периферические — анализируемые нтигены или наоборот. Сыво­ротка и антиген не должны выходить за пределы лунки на поверхность агара. Затем плас­тины помещают в эксикатор. На дно эксикатора наливают небольшое количество воды с антисептиком. Пластины с компонентами выдерживают при комнатной температуре 10.., 72 ч (рис. 62).

Учет результатов: полосы преципитации образуются только в зоне эквивалентнос­ти, т. е. там, где все антитела связаны с антигеном. (Если в жидкой среде соединить экви­валентные количества реаген­тов, то в надосадочной жидко­сти после формирования пре­ципитата не будет свободных антигена и антител.)

При изучении в РДП раз­личных антигенов возможны три варианта результата реакции (рис. 63, 64, 65).

1. Реакция идентичности: слияние линий преципитации, от­носящихся к двум соседним антигенам (у сравниваемых антиге­нов гомологичные детерминанты — антигены оценивают как идентичные).

2. Реакция неидентичности: пересечение линий преципита­ции (у сравниваемых антигенов нет гомологичных антигенных детерминант).

3. Реакция неполной идентичности: неполное пересечение линий преципитации с формированием так называемой «шпо­ры». Такая картина возникает, когда у одного из антигенов по­мимо гомологичных есть и специфические детерминанты, кото­рые второй антиген в составе своей молекулы не несет.

С помощью реакции диффузионной преципитации можно об­наруживать антитела в сыворотке крови и определять их титр. В этом случае в центральную лунку вносят известный растворимый антиген (бактериальный, вирусный), а в периферические — раз­личные разведения исследуемой сыворотки крови (рис. 66).

Чтобы полосы преципитации стали более выраженными, плас­тины обрабатывают солями кад­мия: пластины с готовым гелем отмывают в физиологическом растворе и заливают 0, 65%-м ра­створом сульфата кадмия. В ре­зультате через несколько минут полосы преципитации стано­вятся более ярко выраженными (в несколько раз).

Иммуноэлектрофорез (ИЭФ). Метод электрофоретического разделения антигенных смесей в агаровом геле с последующим выявлением отдельных антиге­нов при помощи реакции диффузионной преципитации. Иммуноэлектофорез применяют для изучения состава сложных антигенных смесей, например микробных растворимых антигенов, белков сыворотки крови и т.д.

Для приготовления агарового геля и заполнения кювет электрофоретической камеры используют различные буферные ра­створы: 1) веронал-мединаловый (барбитуратный) буферный ра­створ, рН 8, 6, ионная сила 0, 05; веронал — 1, 84 г, мединал— 10, 3 г, дистиллированная вода —до 1000 мл; 2) трис-буфер, рН 8, 9; трис (оксиметил)-аминометан — 60, 5 г, этилендиаминотетра-уксусная кислота — 6 г, борная кислота — 4, 6 г, дистиллирован­ная вода — до 1000 мл.

Существует много других буферных растворов, различающих­ся по значениям рН и ионной силе. Ионная сила (р.) равна поло­вине суммы произведения концентрации каждого иона, присут­ствующего в растворе, на квадрат его валентности. Чем ниже ионная сила буфера, тем быстрее двигаются белки, но чрезмер­ное снижение ионной силы ухудшает разделение компонентов.

Для проведения электрофореза расплавленный гель наливают на стеклянные пластины размером (13...18) х (18...24) см (макро­метод) или на предметные стекла (микрометод) слоем толщиной 2...4 мм. Затем в агаровом геле с помощью пробойников выреза­ют лунки для растворов, подлежащих электрофоретическому раз­делению. Если объем жидкости достаточно велик (макрометод), то ее предварительно диализируют против буферного раствора, который используют для электрофореза.

Подготовленную пластину помещают в камеру для электро­фореза (рис. 67, 68). Слой агара на пластине благодаря агаровым «мостикам» или полоскам хроматографической бумаги сообщает­ся с анодной и катодной кюветами, заполненными буферным раствором. Ток через выпрямитель поступает на пластину с агаром (напряжение обычно 300...500 В и силой тока 30...40 А). Если гра­диент потенциала на агаровой пластине составляет 5...6 В/см, то на пластине длиной 18 см разгонка белков завершается за четыре-пять часов, при меньших размерах пластины разгонка проис­ходит быстрее.

По истечении указанного времени пластину с гелем вынима­ют из камеры, в агаре по длине пластины прорезают траншею, которую заполняют иммунной сывороткой. Пластины помещают во влажную камеру. Образование дуг преципитации завершается через несколько сугок-(рис. 69). Электрофореграммы можно вы­сушивать на стеклах, окрашивать или при помощи специальных реактивов определять химическую природу веществ в дугах пре­ципитации.

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

1. Освоить технику постановки и учета результатов кольцевой
РП и РДП.

2. Изучить метод иммуноэлектрофореза, иммунофореграммы.

Контрольные вопросы

1.В чем сущность феномена преципитации?

2.Какова техника постановки кольцевой РП и РДП?

3.Для каких целей применяют метод иммуноэлектрофореза?

Тема 17

РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА (РСК)

Цель занятия. Ознакомить студентов с принципом и техникой постановки реакции связывания комплемента.

Оборудование и материалы. Физиологический раствор, 2, 5%-я суспензия эритроцитов барана в физиологическом растворе, бру­целлезный антиген, положительная бруцеллезная сыворотка, нормальная сыворотка крупного рогатого скота, комплемент морской свинки, гемолизин, мерные пипетки на 1, 5 мл, водяная баня.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

Помимо серологических реакций осадочного типа (РА, РП) в диагностике инфекционных болезней широко используют реакцию связывания комплемента (РСК), в которой факт взаимодействия антигена и антитела устанавливают при помощи специальной ин­дикаторной системы, которую лизирует комплемент. Механизм иммунного лизиса с участием комплемента рассмотрен в теме 15.

РСК применяют как метод серологической диагностики и реже для обнаружения микробных антигенов в исследуемом ма­териале. В РСК с одинаковым успехом можно использовать кор­пускулярные и растворимые антигены.

Комплемент (С) не способен соединяться с антигеном (АГ) или с антителами (AT) в отдельности, но реагирует с образовав­шимся комплексом АГ – AT. В РСК участвуют две системы: АГ – AТ и комплемент.

Исследуемая АГ – АТ-система: искомый компонент (напри­мер, антитела) в ней может количественно варьировать или пол­ностью отсутствовать. При взаимодействии комплемента с сис­темой АГ - AT видимые феномены отсутствуют.

Индикаторная АГ - АТ-система состоит из эритроцитов бара­на (антиген) и гемолизина (антитела к эритроцитам барана). При взаимодействии комплемента с системой АГ - AT наблюдают процесс иммунного лизиса эритроцитов. На конкуренции иссле­дуемой и индикаторной систем АГ - AT за комплемент основана диагностическая РСК. Рассмотрим ее принцип на модели обна­ружения антител в исследуемой сыворотке при помощи извест­ного антигена.

РСК ставят в два этапа. Сначала в пробирку вносят исследуе­мую сыворотку крови, известный антиген и комплемент. Смесь реагентов выдерживают в водяной бане при 37 °С 20...30 мин. Независимо от результата видимых изменений в пробирке не происходит (первая фаза РСК). Чтобы выяснить результат, в пробирку вносят индикаторную систему (вторая фаза РСК). Пос­ле инкубирования всех компонентов учитывают результаты. Воз­можны два варианта результатов.

Антитела в исследуемой Комплекс АГ-АТ-С не образовался, С остался в

сыворотке отсутствуют активном состоянии и способен реагировать с другим

комплексом АГ-АТ, т.е. лизировать индикаторную

систему

Антитела в исследуемой Образовался комплекс АГ-АТ-С, комплемент

Сыворотке присутствуют инактивирован, при внесении в пробирку

Индикаторной системы ее лизис не происходит

Компоненты РСК. При введении всех компонентов в строго определенном количественном соотношении реакция дает дос­товерные и воспроизводимые результаты.

Солевой раствор для разведения компонентов: ис­пользуют физиологический раствор. Более стабильные результа­ты иммунного гемолиза получают при введении в раствор ионов Са2+ и Mg2+, поскольку они необходимы для эффективного дей­ствия системы комплемента.

Эритроциты барана: эритроциты дефибринированной крови барана отмывают физиологическим раствором (2500 мин^-1 три раза по 5 мин). В реакции обычно используют 2, 5%-ю суспензию. При необходимости длительного использова­ния ее хранят в растворе Ольсвера: хлорид натрия — 4, 2 г, ли­монная кислота — 0, 55 г, цитрат натрия — 8 г, декстроза — 20, 5 г, дистиллированная вода—10мл (рН 6, 1). Раствор стерилизуют автоклавированием и смешивают с кровью в соотношении 1: 2. Эритроциты, хранящиеся в растворе Ольсвера при 4...6°С, мож­но использовать в течение З0...40сут.

Гемолизин выпускают биофабрики. Представляет собой сыворотку крови кролика, иммунизированного эритроцитами барана, содержащую антитела к эритроцитам. На коробках с ге­молизином указывают его активность в виде титра, определенно­го в реакции иммунного лизиса.

Комплемент — сыворотка крови морской свинки. Био­фабрики выпускают комплемент в лиофилизированном виде (срок годности 1 год). В случае необходимости комплемент мож­но получить пункцией сердца морской свинки при помощи шприца с иглой.

Антиген: диагностические антигены для РСК готовят на биофабриках. На коробках с антигеном указывают его актив­ность (титр антигена) в виде разведения, рекомендованного для использования в РСК.

Титрование гемолизина. При достаточно длительном хранении необходимо определять активность гемолизина путем его титро­вания в реакции иммунного гемолиза. Результаты этого опыта показывают, в какой оптимальной концентрации необходимо вводить в РСК гемолизин, чтобы обеспечить работу индикатор­ной системы. Титром гемолизина называют его максимальное разведение, при котором в присутствии оптимального количе­ства комплемента гемолизин способен обеспечить полный лизис суспензии эритроцитов.

При титровании готовят вспомогательные разведения гемоли­зина (табл. 9). Их переносят в 8 пустых пробирок и добавляют другие компоненты (табл. 10).

В приведенном примере титр гемолизина составляет 1: 2000 (4-я пробирка). Для постановки РСК обычно берут удвоенное количество гемолизина — в данном случае 1: 1000 (рабочий титр).

Титрование комплемента. Комплемент титруют каждый раз в день постановки главного опыта РСК. За титр комплемента при­нимают его минимальное количество, которое вызывает полный лизис определенной дозы суспензии эритроцитов в присутствии рабочей дозы гемолизина. Комплемент титруют в гемолитичес­кой или бактериолитической системе. Титрование комплемента в гемолитической системе, например, может быть проведено по указанной схеме (табл. 11).

В нашем примере титр комплемента составил 0, 1 мл. Актив­ность комплемента могут снижать антиген и исследуемая сыво­ротка (антикомплементарное действие). Чтобы нивелировать ан-тикомплементарность компонентов, комплемент берут в опыт на 20...40 % больше установленного титра. Для более точного опре­деления титра рекомендуют титровать комплемент в присутствии сыворотки крови и антигена (титрование в бактериолитической системе).

Например, при серодиагностике бруцеллеза комплемент тит­руют на негативной и позитивной сыворотках, полученных от животных того же вида, что и исследуемая сыворотка. Каждую сыворотку разводят физиологическим раствором в соотношении 1: 5 и прогревают в водяной бане для инактивации собственного комплемента: сыворотки крупного рогатого скота — при 60...62 º С, лошадей —при 56...58 °С, буйволов —при 62...64°С, ослов и мулов —при 64...65 º С, овец и коз —при 58...60°С 30 мин, свиней —при 60...62°С 50 мин.

Схема титрования комплемента в бактериолитической систе­ме показана в таблице 12.

Титром комплемента считают минимальное его количество, которое обеспечивает полный гемолиз суспензии эритроцитов в пробирках с негативной сывороткой и антигеном и позитивной сывороткой без антигена. В данном примере титр комплемента равен 0, 1 мл (5-я пробирка). В качестве рабочего титра берут ко­личество комплемента на 0, 02 мл больше, т. е. 0, 12 мл.

Главный опыт РСК. Кроме исследуемых сывороток крови при постановке основного опыта РСК в качестве контрольных ис­пользуют положительную и отрицательную сыворотки крови. Все сыворотки предварительно разводят физиологическим раствором в соотношении 1: 5 и прогревают при 56...64 º С в водяной бане для инактивации собственного комплемента. Схема главного опыта показана в таблице 13.

Результат РСК учитывают по наличию или отсутствию гемо­лиза эритроцитов в пробирках и выражают в крестах: 1)(++++) — полная задержка гемолиза (после оседания эритро­цитов жидкость прозрачная); 2) (+++) — задержка гемолиза сильно выражена (после оседания эритроцитов жидкость слабо­розового цвета); 3) (++) — частичная задержка гемолиза (после оседания эритроцитов жидкость интенсивно окрашена в крас­ный цвет); 4) (+) — слабая задержка гемолиза (незначительный осадок эритроцитов, жидкость интенсивно окрашена); 5) (—) — полный гемолиз, осадка эритроцитов нет.

Как положительный результат РСК оценивают задержку гемо­лиза минимум на два креста и более.

Учет результатов начинают с контрольных пробирок:

7-я пробирка — контроль физиологического раствора: гемоли­за не должно быть;

6-я пробирка — контроль индикаторной системы и компле­мента: должен быть полный гемолиз;

5-я пробирка — контроль антигена: должен быть полный ге­молиз;

3-я пробирка — контроль с отрицательной сывороткой: дол­жен быть полный гемолиз;

2-я пробирка — контроль с положительной сывороткой: долж­на быть задержка гемолиза.

Если все перечисленные контроли свидетельствуют о пра­вильности приготовления компонентов реакции и выборе их доз, приступают к учету результатов РСК с исследуемой сывороткой крови.

Первоначально учитывают результаты в 4-й пробирке (безан­тигенный ряд) — контроль антикомплементарности сыворотки. При полном гемолизе в 4-й пробирке (отсутствие антикомпле­ментарности) можно учитывать результат в 1-й пробирке (анти­генный ряд), где результат может варьировать от полного гемо­лиза (отрицательный результат) до полной задержки гемолиза (положительный результат). Если исследуемая сыворотка антикомплементарна, то результат в первой пробирке учитывать нельзя и от этого животного необходимо брать кровь для повтор­ного исследования. Окончательный учет результатов РСК прово­дят через 18...20 ч, за это время нелизированные эритроциты осе­дают на дно пробирки.

В приведенном примере рассмотрен вариант постановки РСК в объеме 1 мл, когда каждый компонент взят в объеме 0, 2 мл. Возможна постановка РСК в макроварианте (2, 5 мл) или в капельном варианте.

Расчет количества компонентов для постановки РСК. Напри­мер, необходимо исследовать 100 сывороток крови. Сыворотку крови исследуют в разведениях 1: 5, кроме того, с тем же разведе­нием ставят контроль на антикомплементарные свойства сыво­ротки (безантигенный ряд). Следовательно, на каждую сыворотку необходимо 2 пробирки, на 100 сывороток — 200 пробирок. РСК ставим в объеме 1 мл, и каждый компонент необходимо пригото­вить в объеме 40 мл (0, 2*200): гемолизин в рабочем титре, антиген в рабочем титре, 2, 5%-я суспензия эритроцитов барана.

Титр комплемента в нашем опыте составил 0, 12 мл в разведе­нии 1: 20. Следовательно, на 200 пробирок необходимо 24 мл комплемента, разведенного 1: 20 (0, 12*200 = 24), а неразведенного — 1, 2 мл (24: 20 = 1, 2). Ампула (флакон) обычно содержат 2 мл комплемента, и для проведения этого опыта достаточно вскрыть одну ампулу, взять из нее 1, 2 мл комплемента и добавить к 38, 8 мл физиологического раствора.

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

1. Провести титрование гемолизина и комплемента и опреде­лить их рабочие титры.

2. Поставить главный опыт РСК и учесть результаты.

Контрольные вопросы

1. Что представляет собой комплемент морской свинки? Как его консервиру-
ют?

2.На чем основано получение гемолизина?

3.В чем сущность иммунного гемолиза?

4.Что такое титр и рабочий титр гемолизина и комплемента?

5.Какова схема главного опыта РСК?

6.Для чего используют РСК?