Методи визначення мікрофлори води та повітря.

Уперше мікроорганізми в повітрі були виявлені Л. Пастером ще у другій половині XIX ст.Для закритих приміщень санітарними показниками повітря є наявність у ньому стафілококів, зеленявих стрептококів, а показником прямої епідеміологічної небезпеки — гемолітичних стрептококів і стафілококів. Орієнтовним критерієм чистоти повітря учбових приміщень вважають такий стан, коли в 1 м3 міститься не більше як 1500 бактерій і 16 стрептококів.

Своєчасне провітрювання (4-5 раз на день), щоденне вологе прибирання приміщень(2-3 рази на день), систематична вентиляція зменшують кількість мікробів у повітрі.

Кількісний і якісний склад мікрофлори повітря досліджують різними методами.Найпростішим методом визначення мікрофлори повітря є седиментаційний. Набагато точнішим є аспіраційний метод, розроблений Ю.А.Кротовим.

Для дослідження мікрофлори повітря використовують наступні методи:

1. Звичайна седиментація – т. із. чашковий метод Коха із пасивним осадженням мікробів на поверхню щільного поживного середовища за певний годину, зазвичай 5-10хв.

2. Примусова седиментація мікроорганізмів повітря із використанням спеціальних приладів – імпакторів типу приладу Кротова (мікроби осаджують на поверхню щільних поживних середовищ) та імпінджерів типу приладу Дьяконова (при продуванні повітря мікроби поступають в рідкі поживні середовища). Ці методи найбільш надійні, бо дозволяють давати кількісну характеристику забрудненості повітря мікроорганізмами та вивчати їхнього видовий склад.

3. Фільтраційний метод – повітря продувають крізь воду чи мембранні фільтри із наступним мірним висівом на поживні середовища.

Критеріями оцінки мікробіологічного стану повітря замкнених приміщень є:

а) Загальне мікробне число (ЗМЧ) – кількість бактерій в перерахунку на 1м3 повітря, що виросли при посіві на поверхню поживного агару. Посіви інкубують добу при 370С, потім ще добу при температурі ~200С.

б) Індекс санітарно-показових бактерій - кількість в перерахунку на 1м3 повітря умовно-патогенних мікробів дихальних шляхів – гемолітичних стрептококів, золотавого стафілокока, грамнегативних бактерій, дріжджеподібних та цвільових грибів.

Мікрофлора води поділяється на власну (автохтонну) і випадкову (заносну). До постійних бактерій належать актиноміцети, мікрококи, псевдомонади, спірохети, непатогенні вібріони. Із морської води прибережних зон систематично висіваються вібріони, які спричиняють у людей гострі гастроентерити від вживання малосольної морської риби, креветок, мідій.

При забрудненні водоймищ стічними водами виявляють багато кишкових паличок, ентерококів, клостридій, спірил, вібріонів, ентеровірусів і ротавірусів. Анаеробні бактерії у воді зустрічаються рідко. Інколи в неї заносяться і певний час зберігаються хвороботворні мікроорганізми. Так, спори сибіркових бацил зберігаються у воді роками, збудники тифів, ентеровіруси, вірус гепатиту А, лептоспіри - кілька місяців, а збудники дизентерії, холери, бруцельозу - ще менше (дні, тижні). Отже, вода може стати могутнім фактором передачі багатьох інфекційних хвороб.

Санітарно-показовим мікробом для води є кишкова паличка (Escherichia coli).

Визначення БГКП проводять за методом мембранних фільтрів або за методом бродильних проб. До категорії БГКП належать бактерії родини Enterobacteriaceaе, що об’єднує роди Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella. Це грамнегативні, безспорові, оксидазонегативні палички, які ферментують глюкозу і лактозу до кислоти й газу при 37 °С. Вони виділяються в зовнішнє середовище з випорожненнями людей і теплокровних тварин і є кількісним показником ступеня фекального забруднення води. Тому чим більше її фекальне забруднення, тим вища ймовірність контамінації води відповідними патогенними мікроорганізмами.

Серед БГКП окремо виділяють групу коліформних бактерій, а в ній – фекальні кишкові палички (ФКП), які розкладають лактозу при 44, 5 °С. До E.coli відносять бактерії, що не ростуть на цитратному агарі. Саме вони є показником свіжого фекального забруднення. Для його визначення можна використати S.faecalis, який порівняно швидко гине в оточуючому середовищі.

Взяття проб води. Для проведення мікробіологічного аналізу відбирають 500 см3 води у стерильні флакони, закриті ватно-марлевою пробкою, покритою зверху паперовим ковпачком. Взяття проб з водопровідних кранів проводять після обпалювання їх спиртовим факелом і наступного випускання води на протязі 10 хв. Проби хлорованої води беруть у флакони з дехлоратором (на 500 см3 води 2 см3 1, 5 % розчину гіпосульфіту натрію, простерилізованого в автоклаві).

Визначення загального мікробного числа води. Цей показник визначає кількість мезофільних, мезотрофних аеробів і факультативних анаеробів, які виростають на МПА при 37 °С протягом 24 год. Залежно від ступеня ймовірного бактерійного забруднення воду сіють із таким розрахунком, щоб на агарі в чашках виростало від 30 до 300 колоній. Звичайну водопровідну або артезіанську воду сіють у нерозведеному стані в об’ємі 1 см3. Проби з відкритих водойм, криниць, джерел і т.п. сіють після попереднього їх розведення від 10-1 до 10-3 і більше (особливо стічних вод). Для цього в ряд пробірок наливають по 9 мл стерильної води, в першу з них вносять 1 см3 досліджуваної води, ретельно перемішують, із цієї пробірки переносять 1 см3 у другу, потім у третю і всі наступні по 1 см3 попереднього розведення. Для виготовлення кожного розведення необхідно брати нову стерильну піпетку.

Нерозведену або розведену воду в об’ємі 1 см3 вносять, рівномірно розкапуючи, на дно стерильної чашки Петрі, потім заливають її 10-12 см3 розтопленого й охолодженого до 45 °С м’ясо-пептонного агару. Обережними круговими рухами змішують воду з агаром. Як правило, сіють не менше двох розведень і для кожного з них використовують дві чашки. Після застигання середовища посіви вирощують у термостаті при 37°С протягом 24 год. Через добу підраховують число колоній у двох чашках і знаходять середнє арифметичне. При значній кількості колоній підрахунки проводять за допомогою спеціального приладу АПК (апарат для підрахунку колоній). Методика користування ним регламентована спеціальною інструкцією.

Визначення кількості бактерій групи кишкових паличок. Цей показник (індекс БГКП) визначають за допомогою методу мембранних фільтрів і бродильним методом. Мікробіологічні лабораторії частіше використовують метод мембранних фільтрів. Він значно простіший і дає стабільні результати.

Метод мембранних фільтрів. Сутність методу полягає в концентруванні бактерій з певного об’єму досліджуваної води на мембранний фільтр, вирощуванні на середовищі Ендо при 37 °С і підрахунку індексу БГКП в 1 дм3 води.

Промисловість випускає нітроцелюлозні мембранні фільтри під 6 номерами: чим менший номер, тим дрібніший діаметр пор. Для дослідження води використовують фільтри № 2 і № 3. Їх вміщують у підігріту до 80 °С дистильовану воду і ставлять на слабкий вогонь до закипання. Кип’ятять тричі по 15 хв, кожного разу замінюючи воду. Після останнього кип’ятіння воду не зливають, фільтри залишають в ній до вживання.Для фільтрування води використовують апарат Зейтца або прилад Рубльовської водопровідної станції.

Прилади оптирають ватним тампоном, змоченим спиртом, і фламбірують. Після охолодження їх монтують на колбі Бунзена. На нижню частину апарата (столик) кладуть стерильним пінцетом підготовлений мембранний фільтр, прижимають його верхньою частиною приладу (стакан, воронка) і закріплюють пристроєм, передбаченим конструкцією. У воронку (стакан), дотримуючись правил асептики, наливають досліджуваний об’єм води й за допомогою масляного насоса створюють вакуум у колбі Бунзена. Після закінчення фільтрування знімають воронку (стакан), мембранний фільтр беруть обпаленим на вогні пінцетом і вміщують на середовище Ендо так, щоб між агаром і фільтром не було бульбашок повітря. В одній чашці Петрі можна розмістити 3-4 фільтри. Чашки з фільтрами на середовищі Ендо вміщують у термостат догори, інкубують при 37°С протягом 18-24 год.