Гнотипова і фенотипова мінливість у бактерій. Трансдукція, її значення для генної інженерії.

Однією з основних ознак будь-якої живої структури є її мінливість. Не стали винятком в цьому плані численні представники мікробного царства.

Розрізняють два види мінливості мікроорганізмів: неспадкову або модифікаційну та спадкову або генотипну.

Модифікаційна мінливість полягає у зміні різноманітних властивостей мікроорганізмів під впливом факторів навколишнього середовища, однак вона не зачіпає генетичний апарат клітини спадково не передається. Вона зумовлюється адаптаційними механізмами бактеріальної клітини, її здатністю призвичаюватись до умов довкілля за рахунок активації генів, які перебувають у “німому” стані.

Підлягають модифікаціям найрізноманітніші властивості бактерій. Досліджено зміни морфологічних ознак внаслідок старіння клітини, появу довгастих, зігнутих паличок вульгарного протею під впливом фенолу (рис. 5.5), зміну морфології холерного вібріона в результаті дії гліцерину. Під впливом пеніциліну, лізоциму, специфічних імунних сироваток грампозитивні та грамнегативні бактерії можуть втрачати свою клітинну стінку, перетворюючись у L-форми. Клітина при цьому втрачає свою типову морфологію, набуває кулястої форми, в ній можуть з’являтись дрібні зерна, вакуолі. Після припинення дії агента вони набувають звичного виду (рис. 5.6).

Отже, модифікаційні зміни нетривалі, характеризують ступінь пристосування бактерій до нових умов існування, вони є нормою реакції клітини, засвідчуючи потенційну здатність генотипу реагувати на змінені умови існування.

При генотипній мінливості мікроорганізмів різноманітні ознаки бактерій успадковуються та передаються нащадкам. Вона може розвиватись внаслідок мутацій та рекомбінацій.

Мутаціями називають будь-які зміни послідовності нуклеотидів гена, що змінюють його структуру, а відповідно, й функціонування, але не пов’язані з рекомбінаційним процесом. Вважається, що мутаційний процес лежить в основі еволюції мікроорганізмів у природі. Послідовність нуклеотидів може змінитись або при заміні однієї пари основ на іншу внаслідок помилки під час реплікації або при розриві ДНК з наступним випадінням чи інверсією фрагменту, який лежить між точками розриву, або внаслідок вставки якогось нового фрагменту.

Класифікувати мутації можна з різних точок зору. За своїм проявом їх можна поділити на морфологічні, фізіологічні, біохімічні та інші залежно від виду ознаки, яка змінилась внаслідок мутації. Серед морфологічних ознак може змінитись забарвлення або характер колонії бактерій. Інша група - це мутації стійкості. Після них мікроорганізм набуває здатності, наприклад, переносити токсичні концентрації речовин, які пригнічують ріст диких штамів (резистентність до антибіотиків). До біохімічних мутацій належать прояви ауксотрофності та прототрофності.

За своїм походженням мутації поділяють на спонтанні та індуковані. Спонтанні мутації відбуваються з частотою 105-1012 без втручання експериментатора, за, нібито, оптимальних умов існування мікробів. Вони виникають внаслідок дії якихось не встановлених навколишніх факторів.

Індуковані мутації виникають під впливом дії на клітину встановлених мутагенних факторів. Частота їх на декілька порядків вища, ніж спонтанних.

За локалізацією мутації подіяють на нуклеоїдні, які виникають в нуклеоїді клітини, та цитоплазматичні, що виникають у позахромосомних елементах спадковості - плазмідах; за кількістю генів, які мутували, - на генні та хромосомні, за величиною - на великі (хромосомні) та малі (точкові).

Хромосомні мутації частіше бувають інверсіями (фрагмент ДНК в молекулі перевертається на 180°), дуплікаціями (подвоєння ділянки хромосоми), делеціями (випадіння частини хромосоми), дислокаціями (відбувається зміна локалізації ділянки

Трансдукція

Виділяють три основні види трансдукції: специфічну, загальну або генералізовану та абортивну.

Специфічна трансдукція характеризується здатністю бактеріофагів переносити лише певні гени від бактерії донора, які локалізуються по обидві сторони від місця інтеграції фага в геном клітини. Наприклад, фаг l E. coli має сайт інтеграції в хромосому бактерій між генами gag i bio, які кодують відповідно ферментацію галактози й синтез біотину. При виході з бактеріальної хромосоми, він захоплює частку генетичного матеріалу донора (гени gag i bio), а сам при цьому втрачає частину власного генома. Такий бактеріофаг називають дефектним, тому що кількість власної ДНК обмежена за рахунок включення генома хазяїна (рис. 5.13). Бактеріофаг j 80 переносить тільки триптофановий ген кишкових паличок.

Клітини, які лізогенізовані дефектними фагами, стають несприйнятливими до зараження гомологічними вірулентними бактеріофагами.

Під час формування головки бактеріофага і збирання фагових корпускул у нього може проникнути, отже, передатись бактерії-реципієнту, будь-який фрагмент ДНК бактерії-донора, наприклад, ген, що зумовлює резистентність до антибіотиків.

Отже, фаг просто переносить генетичну інформацію, а його власна ДНК не бере участі в утворенні рекомбінантів.

Процес трансдукції відрізняється від лізогенної конверсії, яку також забезпечують помірні бактеріофаги. При останній клітина набуває нових властивостей за рахунок експресії в ній власних генів фага. Яскравим прикладом такого явища є перенос tox+ генів дифтерійних фагів у дифтерійні палички, внаслідок чого вони набувають токсигенних властивостей. Аналогічне явище спостерігається у збудників ботулізму, стафілококів.

При абортивній трансдукції фагова ДНК та гени бактерії-донора не інтегруються в хромосому реципієнта, а залишаються в цитоплазмі. Під час поділу клітини вони передаються тільки одній з дочірніх клітин, а згодом просто елімінуються з неї.

Явище неспадкової та спадкової мінливості спостерігається також у вірусів. Модифікаціям підлягають склад білків капсиду, суперкапсиду, який зумовлюється впливом клітинних компонентів при репродукції віріонів.

Як прояв генотипової мінливості, у вірусів виявлено також феномени мутацій та рекомбінацій. Внаслідок мутацій можуть змінюватись розміри бляшок під агаровим покриттям, нейровірулентність вірусів для тварин, чутливість їх до дії хіміотерапевтичних препаратів. Завдяки мутаціям, які виникли при пасажах вірусів через мозок кроликів, одержано фіксований вірус, а при пасажах через мозок курчат - штам Флюрі, які використовуються при створенні антирабічних вакцин для активної профілактики сказу. При зараженні чутливої клітини одночасно декількома вірусами спостерігаються прояви численних генетичних рекомбінацій: множинна реактивація, пересортування генів, крос-реактивація, гетерозиготність, транскапсидація. Вони зустрічаються також in vivо, що дозволяє по-новому оцінити деякі сторони розвитку вірусних інфекцій.

37.

Метод окраски по Цилю — Нельсену — метод окраски микроорганизмов для выявления кислотоустойчивых микобактерий (возбудителей туберкулёза, микобактериозов, лепры), актиномицетов и других кислотоустойчивых микроорганизмов. Кислотоустойчивость микроорганизмов обусловлена наличием в их клетках липидов, воска и оксикислот. Такие микроорганизмы плохо окрашиваются разведёнными растворами красителей. Для облегчения проникновения красителя в клетки микроорганизмов нанесённый на препарат карболовый фуксин Циля подогревают над пламенем горелки. Окрашенные микроорганизмы не обесцвечиваются слабыми растворами минеральных кислот и спирта.

Этапы окраски

1. Фиксированный мазок покрывают плоской фильтровальной бумагой и наливают на неё карболовый фуксин Циля. Мазок подогревают над пламенем горелки до появления паров, затем отводят для охлаждения и добавляют новую порцию красителя. Подогревание повторяют 2—3 раза. После охлаждения снимают фильтровальную бумагу и промывают препарат водой.

2. Препарат обесцвечивают путем погружения или нанесения на него 25%-го раствора серной кислоты или 3% солянокислого спирта в течение 3-х минут, и промывают несколько раз водой.

3. Окрашивают препараты водно-спиртовым раствором метиленового синего 1 минуту, промывают водой и высушивают.

При окраске по методу Циля — Нельсена кислотоустойчивые бактерии приобретают интенсивно красный цвет, остальная микрофлора окрашивается в светло-синий цвет[1].