Рибонуклеаза.

Рибонуклеаза (РНКаза) поджелудочной железы быка гидролизует межнуклеотидные связи в РНК около пиримидиновых звеньев, которые при этом остаются этерифицированными по 3'-положению. Фермент наряду с другими нуклеазами широко используется при анализе структуры РНК.

РНКаза образована одной полипептидной цепью, содержащей 124 аминокислотных остатка; в молекуле имеется четыре дисульфидных связи. РНКаза является первым ферментом, для которого была установлена первичная структура.

На основании результатов исследования ренатурации рибонуклеазы К. Анфинсен впервые четко сформулировал представление о том, что пространственное строение белка определяется его первичной структурой.

В 1958 г. Ф. Ричарде показал, что в определенных условиях субтилизин расщепляет в РНКазе пептидную связь Ala-20–Ser-21. Образующиеся фрагменты были названы S-пептидом (остатки 1-20) и S-белком (остатки 21-124); за счет нековалентных взаимодействий фрагменты образуют комплекс, названный РНКазой S. Этот комплекс обладает почти полной каталитической активностью нативного фермента; в изолированном виде S-пептид и S-белок неактивны. Далее было установлено, что синтетический пептид, идентичный по последовательности фрагменту S-пептида, содержащему остатки с 1 по 13, восстанавливает активность S-белка, однако более короткий пептид, содержащий остатки с 1 по 11, такой способностью не обладает. Полученные данные позволили сделать заключение о том, что соответствующие остатки His-12 или Met-13 (или оба этих остатка) входят в активный центр фермента.

При исследовании влияния рН на активность РНКазы была выяснена важная роль функциональных групп белка с рК 5, 2 и 6, 8; это позволяло предполагать участие в каталитическом акте остатков гистидина. При карбоксиметилировании РНКазы иодацетатом при рН 5, 5, т. е. в условиях, при которых преимущественно происходит модификация остатков гистидина, наблюдалась полная утрата активности. Было определено, что модифицированный фермент содержит 1 моль карбоксиметильных групп на 1 моль белка. В результате образуются две монокарбоксиметилированные формы фермента. В одной форме карбоксиметилированным является остаток His-12, а в другой – His-119. Преимущественно модифицировался His-119. Эти данные позволяли предполагать, что остатки His-12 и His-119 находятся в активном центре и что модификация одного из них препятствует модификации другого.

Позднее, в результате рентгеноструктурных исследований было выяснено пространственное строение РНКазы S и комплекса РНКазы S с ингибиторами. На рисунке приведено строение РНКазы S. Видно, что молекула имеет форму почки, активный центр локализован в углублении, где находятся остатки His-12, His-119 и Lys-41.

Предполагаемая схема каталити-ческого процесса, осуществляемого РНКазой, дана на рисунке. Гидролиз происходит в результате сопряженного действия остатков His-12 и His-119, осуществляющих кислотно-основный катализ. Стадии каталитического процесса:

1. Субстрат находится в активном центре; Η is-12 и His-119, а также Lys-41 расположены около отрицательно заряженного фосфата.

2. В результате действия His-12 как основания, акцептирующего протон от 2'-ОН-группы рибозы, и His-119 как кислоты, отдающей протон атому кислорода фосфата, образуется сначала промежуточный комплекс, а затем 2', 3'-циклический фосфат.

3. На место ушедшего продукта поступает вода, отдающая протон His-119, а ОН – фосфату, одновременно протон от His-12 переходит к кислородному атому рибозы, образуется второй продукт, а фермент возвращается в исходное состояние.