Количественное определение белков методом спектрофотометрии с использованием реактива Бенедикта

Для выделения белковой фракции около 0, 9375 г (точная навеска), образца лиофилизированного маточного молочка измельчали в фарфорофой ступке с 4-кратным (по массе) количеством фосфатного буфера с рН 8, содержащим 0, 2% бисульфида натрия. Полученный гомогенат заливали 10 мл холодной кислотой трихлоруксусной 5%, тщательно перемешивали и помещали в холодильник на 20 минут. Затем переносили в центрифужные пробирки и центрифугировали в течение 15 минут при 3000 об/мин. После центрифугирования надосадочную жидкость сливали и фильтровали. Фильтрат переносили в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляли 0, 2 мл реактива Бенедикта, доводили водой до метки. Спектр поглощения полученного раствора измеряли на спектрофотометре СФ - 56, в кювете с толщиной рабочего слоя 10 мм. Параллельно проводили такое же определение со стандартным раствором альбумина, содержащего 9, 98% белка. Взяли 1 мл стандартного раствора альбумина и поместили в мерную колбу вместимостью 25 мл. Затем прибавляли 0, 2 мл реактива Бенедикта и доводили водой до метки, далее измеряли спектр поглощения стандартного раствора альбумина.

Максимальная оптическая плотность для лиофилизированного маточного молочка наблюдалась при 330 нм. (Рисунок 1)

Рисунок 1 - Спектр поглощения маточного молочка с реактивом Бенедикта.

Содержание белка рассчитывали по формуле (1).

, (1)

где Ах – оптическая плотность исследуемого раствора;

Аст – оптическая плотность раствора альбумина с концентрацией 9, 98%;

ах – навеска лиофилизированного маточного молочка;

С% – концентрация стандартного раствора альбумина;

Wx, Wст. – объем мерных колб;

Vст. – объем аликвоты стандартного раствора альбумина.

Результаты количественного определения методом спектрофотометрии с использованием реактива Бенедикта представлены в таблице 2.

Таблица 2.

Результаты количественного определения белка в маточном лиофилизированном молочке с использованием реактива Бенедикта

№ п/п	Содержание белка, %(Хi)	хi-xср	(хi-xср)2	Метрологические характеристики
1.	6, 24	- 0, 16	0, 0256	S= = = 0, 1772   Sx = = = 0, 072 ∆ x= = 0, 072*2, 571 = 0, 1859
2.	6, 49	0, 09	0, 0081
3.	6, 62	0, 22	0, 0484
4.	6, 43	0, 03	0, 0009
5.	6, 48	0, 08	0, 0064
6.	6, 14	-0, 26	0, 0676	ε = 2, 9%
	Xср =6, 4		Σ (Xi-Xср)² =0, 157

t – коэффициент Стьюдента при числе степеней свободы f = n – 1 и двухсторонней доверительной вероятности Р (0, 95).

Количественное определение белков методом спектрофотометрии с использованием реактива Бенедикта также было проведено для нативного маточного молочка. Максимальная оптическая плотность для нативного маточного молочка наблюдалась при 300 нм. Результаты количественного определения приведены в таблице 3.

Таблица 3.

Результаты количественного определения белка в нативном маточном молочке с использованием реактива Бенедикта

№ п/п	Содержание белка, %(Хi)	хi-xср	(хi-xср)2	Метрологические характеристики
1.	7, 64	0, 16	0, 0256	∆ x= = 0, 0643*2, 571 = 0, 1652     ε = 2, 2%
2.	7, 48
3.	7, 39	-0, 09	0, 0081
4.	7, 57	0, 09	0, 0081
5.	7, 23	-0, 25	0, 0625
6.	7, 62	0, 14	0, 0196
	Xср =7, 48		Σ (Xi-Xср)² =0, 1239

t – коэффициент Стьюдента при числе степеней свободы f = n – 1 и двухсторонней доверительной вероятности Р (0, 95).