![]() Главная страница Случайная страница КАТЕГОРИИ: АвтомобилиАстрономияБиологияГеографияДом и садДругие языкиДругоеИнформатикаИсторияКультураЛитератураЛогикаМатематикаМедицинаМеталлургияМеханикаОбразованиеОхрана трудаПедагогикаПолитикаПравоПсихологияРелигияРиторикаСоциологияСпортСтроительствоТехнологияТуризмФизикаФилософияФинансыХимияЧерчениеЭкологияЭкономикаЭлектроника |
Методы изучения регуляции клеточного цикла
Даже вышеприведенное краткое описание клеточного цикла (и митоза как его части) показывает, сколь много событий происходит всего лишь за 24-36 часов (составляющих обычную продолжительность цикла. Очевидно, все это управляется на молекулярном уровне. Т. е. за, казалось бы, чисто морфологическими явлениями стоит некое множество молекул-регуляторов, которое воспринимает митогенные сигналы и затем последовательно инициирует строго определенные события. Как же расшифровывалась такая сложная молекулярная «кухня»? Это достаточно интересно и поучительно, поэтому хотя бы очень бегло расскажем о соответствующих экспериментах. Их можно поделить на три типа: а) эксперименты по слиянию клеток, б) изучение делений бластомеров, в) исследования мутантов (в основном, дрожжей).
а) Эксперименты по слиянию клеток. Здесь используются клетки, растущие в культуре. Вот наиболее характерный эксперимент: специальной обработкой добиваются попарного слияния клеток двух видов - одни находятся в G1-, а другие — в S-периоде цикла. (Для краткости их будем обозначать соответственно G1 и S-клетки.) Образующиеся химерные клетки содержат по два ядра, причем на момент слияния в одном (нз S-клетки) происходит синтез ДНК, а в другом (из G1-клетки) нет. Так вот, через не большое время синтез ДНК начинается и во втором ядре. Следовательно, в S-клетке содержатся некие факторы, способные диффундировать в ядра G1-клеток и инициировать репликацию ДНК. Очевидно, это те самые факторы, которые вызывают переход клеток из G1-периода в S-период. Но если аналогичный эксперимент произвести с G2- и S- клетками, то результат будет отрицательным: в G2-ядре (уже содержащем удвоенный набор ДНК) репликация ДНК не начинается. Значит, в G2-ядрах имеется механизм, который блокирует избыточную репликацию даже при действии стимулирующих факторов. Весьма показательны также эксперименты с М-клетками (т. е. клетками, находящимися в митозе). В них нет ядерной оболочки. После же слияния с ними любых ннтерфазных клеток (G1-, S- или G2-клеток) ядерная оболочка последних также разрушается, а хромосомы подвергаются конденсации. Это свидетельствует, во-первых, о том, что в митотических клетках присутствуют регуляторные факторы, запускающие митоз. Во-вторых, в отличие от синтеза ДНК, контроль над запуском митоза не столь жесткий, так что возможно преждевременное вхождение в митоз (не только из G2-. но также из G1- и S- периодов). С этим обстоятельством могут быть связаны определенные нарушения клеточного цикла.
б) Изучение делений бластомеров. В данном случае объектом исследования служили крупные яйцеклетки амфибий и морских ежей, а также образующиеся из них зародыши самых ранних стадий развития. Как известно, на этих стадиях интенсивно происходят митотические деления, причем у зародышей амфибий (как и морских ежей) все клетки делятся одновременно. Кроме того, укапанные объекты удобны тем, что могут быть получены в достаточна. больших количествах. Все это позволяет осуществлять i.биохимический анализ — фракционировать содержимое клеток, находящихся на определенной стадии цикла, и производить очистку соответствующих белковых факторов. А как проверить биологическую роль выделяемых факторов? Примерно так же, как это делалось в экспериментах предыдущего типа. А именно: ввести либо клеточный экстракт, либо определенную его фракцию в ооциты. покоящиеся в самом начале мейоза. Если в изучаемом образце содержатся факторы, запускающие деления, ооциты «просыпаются» и вступают в мейотические деления, превращаясь в яйцеклетку. Положительные результаты такого тестирования, между прочим, означают, что механизмы митотических и мейотическнх делений во многом близки. Более того: оказалось, что данный тест можно использовать для оценки экстрактов из делящихся клеток не только самих амфибий, но и других животных, в т. ч. млекопитающих.
в) Исследования мутантов. Как уже отмечалось, в этих генетических экспериментах использовались, в основном, дрожжи. В вегетативной фазе жизнедеятельности их клетки гаплоидны (содержат по одной копии генов), что облегчает выявление мутаций. Мутации можно индуцировать разными способами: облучением, нагреванием, химическими агентами. Такие исследования показали, что некоторые мутации нарушают клеточный цикл. При этом характерным образом меняются размеры клеток. При т. н. cdc-мутациях (от cell division cycle цикл деления клеток) блокировано деление клеток, отчего последние только растут в длину (не почкуясь) и достигают очень больших размеров. Напротив, при т. н. wee-мутациях (wee — крошечный) деления происходят раньше времени — до того, как клетка успела достаточно удлиниться; поэтому получаются клетки очень малой длины. Выяснилось, что проявляться как cdc мутация могут повреждения разных генов: то одного, то другого, то третьего — и т. д. То же относится к мутациям wee. Следовательно, все эти гены ответственны за регуляцию клеточного цикла. А чтобы идентифицировать конкретный продукт каждого такого гена, поступают следующим образом: - выделяют ДНК из нормальных клеток, - фрагментируют ее с помощью рестриктаз, -включают получающиеся фрагменты нормальной ДНК в состав различных плазмид - и вводят плазмиды с испытуемым фрагментом в мутантные клетки. Если мутация - рецессивная, а введенный фрагмент ДНК содержит «правильную» версию мутированного гена, то клеточный цикл нормализуется и образуется колония клеток обычного размера. Так становится известным очередной ген, отвечающий за клеточный цикл. После этого сравнительно нетрудно выяснить природу белка, который кодируется данным геном и является одним из регуляторов цикла. До сих пор речь шла лишь о генах н белках дрожжей. Но белки, регулирующие клеточный цикл, высококонсервативны, т. е. сравнительно мало изменились за время эволюции. Поэтому соответствующие гены даже человека, будучи введенными с плазмидами в мутантные дрожжевые клетки, часто способны восстановить у последних нормальный клеточный цикл. Следовательно, данная модель подходит для изучения регуляторных генов и высших животных.
|