Методы создания пептидной связи

Образование пептидной связи в общем сводится к отщеплению элементов воды. Чтобы обеспечить ее высокую скорость и полноту, необходимо «активировать» карбоксильную группу. Такая активация должна сводиться к увеличению электрофильности карбонильного углерода С^{δ +}.

Хлорангидридный метод. Хлорангидридный метод в настоящее время применяется редко, так как сопровождается рацемизацией и образованием побочных продуктов. Хлорангидриды получаются обычно обработкой и химической модификацией производных аминокислот и пептидов хлористым тионилом или белков и пептидов пятихлористым фосфором.

Азидный метод. Метод Т. Курциуса находит широкое применение в синтезе пептидов. Гидразиды получаются либо прямым гидразинолизом эфиров защищенных аминокислот или пептидов, либо из защищенных гидразидов (–СО–NH–NH–Z–, –СО–NH–NH–Вос и т. д.). Перевод в азиды осуществляется обработкой водным раствором нитрита натрия в кислой среде при 5 С или действием изоамилнитрита или трет-бутилнитрита при 20 С в органическом растворителе (модификация Хонцля и Рудингера, 1961). Азиды можно получать и непосредственно из НООС-производных с помощью дифенилфосфорилазида N₃PO(OC₆H₅)₂, применяемого в качестве конденсирующего агента (в частности, для получения циклопептидов).

Метод смешанных ангидридов. Симметричные ангидриды ациламинокислот легко получаются обработкой последних дициклогексил-карбодиимидом (ДСС) или этоксиацетиленом.

Более распространенным является метод смешанных ангидридов, который в последнее время широко используется в твердофазном синтезе. Быстрый ступенчатый метод синтеза пептидов с использованием избытка смешанных ангидридов носит название REMA-синтеза. К этой группе методов можно отнести и синтез пептидов с применением в качестве конденсирующего средства 1-этоксикарбонил-2-этокси-1, 2-дигидрохинолина.

Метод активированных эфиров. Среди арильных активированных эфиров наиболее широко используются п-нитрофениловые (–ONp), 2, 4-динитрофениловые, о-нитрофениловые и о-нитротиофениловые, 2, 4, 5-трихлорфениловые (–ОТср), пентахлорфениловые (–ОРср). Особое значение приобрели предложенные Л. Кишфалуди высокореакционноспособные пентафторфениловые эфиры (–OPfp). Ариловые эфиры этих типов получаются обычно из соответствующих фенолов с помощью карбодиимида.

В последние годы большое распространение получили активированные эфиры на основе производных гидроксиламина, прежде всего N -гидроксисукцинимидные эфиры.

Карбодиимидный метод. Дициклогексилкарбодиимид предложен в 1955 г. Дж. Шиэном и Г. Хессом при синтезе пенициллина. Первой стадией реакции является активирование карбоксильного компонента путем образования реакционноспособного производного О-ацилизомочевины.

Производное О-ацилизомочевины превращается в пептид непосредственно или через соответствующий симметричный ангидрид. Главным побочным процессом является О → N -ацильный сдвиг, приводящий к получению нереакционноспособных побочных продуктов – N -ацилизомочевин.

Карбоксиангидридный метод. В 1966 г. Р. Хиршман предложил использовать для направленного синтеза пептидов в водной среде N -карбоксиангидриды (NCA, ангидриды Лейкса, оксазолидиндионы). Суть предложенного им приема заключается в точном регулировании рН среды: конденсация N -карбоксиангидрида с аминокислотой проводится при рН 10, 2, при подкислении осуществляется N -декарбоксилирование производных карбаминовой кислоты, и затем цикл реакций повторяется (иногда такой прием обозначается как «рН-весы»). Этим методом, в котором построение цепи ведется от С - к N -концу, Р. Хиршман получил весьма длинные пептидные фрагменты S -белка рибонуклеазы. Рацемизация, т. е. полная или частичная потеря оптической чистоты одного или более аминокислотных остатков, является главной побочной реакцией в пептидном синтезе, накладывающей жесткие ограничения на выбор защитных групп и методов конденсации. Рацемизация приводит к образованию оптически неоднородных продуктов, разделение которых по мере удлинения цепи резко осложняется и превращается в практически не осуществимую задачу.

Синтез на полимерном носителе. Пептидный синтез в классическом варианте сопряжен со значительными затратами труда и времени. С целью создания более эффективной методологии Р. Меррифилд в 1963 г. предложил твердофазный метод синтеза пептидов. Идея его состоит в закреплении растущей полипептидной цепи на полимерном нерастворимом носителе. При этом значительно упрощаются операции выделения промежуточных продуктов, которые сводятся к экстракции и фильтрованию полимера, полностью снимается проблема нерастворимости пептидов и создаются предпосылки для автоматизации процесса. Определяющим фактором в твердофазном синтезе является полнота протекания всех химических реакций, которая достигается за счет применения избытка конденсирующего агента и N -защищенной аминокислоты, отделяемых экстракцией. Естественно, выбор защитных группировок и методов конденсации должен обеспечить полное отсутствие рацемизации. Наилучшие результаты достигаются при использовании Вое-, Врос- и Fmoc-защитных групп, методов симметричных ангидридов и дициклогексилкарбодиимидного. Успешное проведение синтеза на твердом полимере требует применения высокоочищенных реагентов и растворителей на всех стадиях процесса. Первый твердофазный синтез гормона брадикинина был проведен Р. Меррифилдом с общим выходом 70%. В качестве носителя наиболее широко используется микропористый хлорметилированный сополимер стирола и дивинилбензола, хорошо набухающий в органических растворителях и обладающий химической и механической прочностью.

Полусинтез пептидов и белков. Полусинтез (семисинтез, частичный синтез) – способ получения соединений, заключающийся в комбинировании природных пептидов и белков или их фрагментов с пептидами, полученными полным синтезом или модификацией природных объектов. Полусинтез можно рассматривать как методический прием, основанный на модификации природных соединений. Известные в структурной химии белка способы ферментативного и химического расщепления пептидной цепи и разделение образующихся в результате фрагментов с помощью хроматографической техники позволяют получать гомогенные пептидные блоки. С помощью различных методов можно осуществить целенаправленное изменение нужного фрагмента (укорочение, удлинение, введение новых остатков и т. п.) и затем собрать из блоков новые, видоизмененные последовательности. Защитные группы при полусинтезе выбираются таким образом, чтобы их введение сохраняло способность производных растворяться в водных и водно-органических растворах. При сборке нужной последовательности из подготовленных пептидных блоков чаще всего используются такие методы, как DCC/HOBt, DCC/HOSu, а также азидный метод и метод активированных эфиров. Особое внимание уделяется при этом проблеме рацемизации.

Синтез циклопептидов. Для получения циклических пептидов используются обычные для пептидного синтеза методы создания амидной связи. Чаще всего первоначально создается линейный предшественник в виде защищенного пептида, активируется С -концевая карбоксильная группа, освобождается N -концевая аминогруппа и проводится реакция аминолиза собственной аминогруппой пептида. Для уменьшения межмолекулярных реакций аминолиза, приводящих к полимеризации и вследствие этого циклоолигомеризации, реакции циклизации проводят в условиях высокого разбавления в инертных растворителях. Однако, как правило, побочные реакции полимеризации всегда имеют место и уменьшают выход циклического продукта. Лучшие результаты дает метод получения циклопептидов на полимерном носителе.