Результаты по прослеживанию распространения болезни

Вопросы к лабораторной работе

1. Образцы, которые вы добавляете в лунки плашки, содержат множество разных белков, а также могут содержать или не содержать антиген. Что случится с белками в составе образца в лунке в случае, если образец содержит антиген? Если не содержит?

1. Почему необходимо на каждом этапе промывать лунки?

1. Что происходит, когда вы добавляете первичные антитела к образцам, содержащим антиген? Не содержащим антиген?

1. Что происходит, когда вы добавляете вторичные антитела к образцам, содержащим антиген? Не содержащим антиген?

1. Если ИФА дал отрицательный результат по агенту, вызывающему болезнь, означает ли это, что у вас нет данной болезни? По каким причинам результат может быть отрицательным в случае если вы на самом деле больны?

1. Почему вы проводите анализ ваших образцов в трех повторностях?

1. Какие основанные на антителах тесты вы можете купить в аптеке?

1. Если вы получили положительный результат теста в вашей работе, скажите, обменивались ли вы образцами с учениками, исходно получившими «зараженные» пробирки? Если нет, какие выводы вы можете сделать о распространении болезней в популяции?

Протокол II: ИФА для обнаружения антигена

Руководство преподавателя

Эта работа представляет из себя тест на наличие антигена в образце. Вы можете обсудить со своими учениками, как ИФА используется для того, чтобы обнаружить болезнетворные бактерии или вирусы в биологических образцах, например, в крови еще до того, как болезнь начала развиваться. Например, если вовремя (в течение 2-3 дней после инфекции) ввести вакцину человеку, зараженному вирусом оспы, он не заболеет. Вы также можете обсудить не связанные с болезнями применения ИФА, такие как тест на беременность с помощью определения ХГЧ, тесты на допинг, а также тестирование пищи для выявления белков из генномодифицированных организмов.

Тест-полоски на беременность и наркотики, которые вы можете купить в аптеке, также основаны на очень сходных с ИФА принципах.

Для того, чтобы лучше представлять себе контекст работы, ознакомьтесь с приложениями А, Б и В.

План уроков

Общий план работы

Шаг 1: с помощью микропипетки 50 мкл из образца каждого ученика, вместе с положительным и отрицательным контролями, добавляется в лунки плашки и инкубируется 5 минут, чтобы дать возможность белкам в составе образца связаться со стенками лунки. Затем лунки промываются промывочным буфером (PBST: фосфатно-солевой буфер, содержащий 0.05% Твин 20) который кроме того блокирует оставшиеся свободными возможные места связывания для белков в лунке.

Шаг 2: в каждую лунку добавляется 50 мкл раствора первичных антител и инкубируется 5 мин при комнатной температуре. Первичные антитела узнают антигены и связываются с ними. Затем лунки опять промываются промывочным буфером, чтобы удалить несвязавшиеся антитела.

Шаг 3: в каждую лунку добавляется 50 мкл раствора вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой и инкубируется 5 мин. Вторичные антитела узнают первичные антитела и связываются с ними. Пероксидаза это фермент, который окисляет хромогенный субстрат, что изменению его цвета. Лунки промываются PBST чтобы удалить несвязавшиеся вторичные антитела.

Шаг 4: в каждую лунку добавляется 50 мкл раствора субстрата (ТМБ) и ученики наблюдают за развитием окраски. Если в образце присутствовал антиген, то в данной лунке также будет присутствовать пероксидаза, и в течение 5 минут раствор в лунке посинеет. Если антигена в образце не было, раствор останется бесцветным.