![]() Главная страница Случайная страница КАТЕГОРИИ: АвтомобилиАстрономияБиологияГеографияДом и садДругие языкиДругоеИнформатикаИсторияКультураЛитератураЛогикаМатематикаМедицинаМеталлургияМеханикаОбразованиеОхрана трудаПедагогикаПолитикаПравоПсихологияРелигияРиторикаСоциологияСпортСтроительствоТехнологияТуризмФизикаФилософияФинансыХимияЧерчениеЭкологияЭкономикаЭлектроника |
Культивирование и индикация вирусов
Культивирование вирусов человека и животных проводят:
Вирусы культивируют трех биологических моделях: в организме лабораторных животных, в развивающихся эмбрионах птиц (чаще на куриных эмбрионах) и в культурах клеток (тканей). Выращенные вирусы определяют с помощью методов индикации и идентификации. Индикация, т.е. обнаружение факта их репродукции, основана на выявлении различных биологических свойств вирусов и особенностей их взаимодействия с чувствительными клетками. Идентификация (определение вида, типа) вирусов осуществляется, в основном, с помощью иммунологических реакций, основанных на взаимодействии антигенов вирусов и соответствующих им АТ. Лабораторных животных (взрослых или новорожденных белых мышей, хомяков, морских свинок, обезьян и др.) заражают исследуемым вируссодержащим материалом различными способами (подкожно, внутримышечно, интраназально, интрацеребрально) и в зависимости от тропизма вирусов. Использование животных для культивирования вирусов в диагностических целях весьма затруднено из-за видовой невосприимчивости животных ко многим вирусам человека, контаминации животных посторонними вирусами, а также по экономическим и этическим соображениям. В некоторых случаях биологический метод может явиться единственным в диагностике вирусных инфекций (б о льшая часть медленных вирусных инфекций), а также для получения чистых культур вируса (вирусы Коксаки, ECHO, лимфоцитарный хориоменингит и др.); или как дополнительный метод исследования при диагностике (заражение в роговицу для определения наличия герпесвируса и исследуемом материале). При использовании биологического метода с целью диагностики заболевания необходимо знать, что определенные вирусы культивируются на определенных экспериментальных животных и при определенном способе заражения и сроке введения материала. Например, при диагностике некоторых медленных вирусных инфекций заражение проводят у постели больногоинтрацеребральномышатам-сосункам (1-2 суточным), т.е. здесь имеет значение вид животного, возраст животного, время от забора до введения материала и способ введения материала (заражения). Экспериментальные животные в вирусологии применяются для следующих целей:
О продукции вирусов в организме животных судят по развитию у них видимых клинических проявлений заболевания, патологическим изменениям органов, и а также на основании реакции гемагглютинации (РГА) с суспензией из органов, содержащих вирусы.
Куриные эмбрионы (5—12-дневные) заражают путем введения исследуемого материала в различные полости и ткани зародыша. Таким образом можно культивировать вирусы гриппа, герпеса, натуральной оспы и др. Достоинствами модели являются: возможность накопления вирусов в больших количествах; отсутствие скрытых вирусных инфекций; доступность для любой лаборатории. О репродукции вирусов в куриных эмбрионах свидетельствуют: специфические поражения оболочек и тела эмбриона (оспины, кровоизлияния); гибель эмбриона; положительная РГА с вируссодержащей жидкостью, полученной из полостей зараженного зародыша. Методику культивирования вирусов в развивающихся эмбрионах птиц используют при промышленном выращивании вирусов. Однако многие вирусы не размножаются в эмбрионах птиц; почти неограниченные возможности для культивирования вирусов появились после открытия метода культур клеток. Культуру клеток (тканей) наиболее часто применяют для культивирования вирусов. Метод культур клеток разработан в 50-х годах XX века Дж. Эндерсом и соавт., получившими за это открытие Нобелевскую премию. Клетки, полученные из различных органов и тканей человека, животных, птиц и других биологических объектов, размножают вне организма на искусственных питательных средах в специальной лабораторной посуде. Большое распространение получили культуры клеток из эмбриональных и опухолевых (злокачественно перерожденных) тканей, обладающих, по сравнению с нормальными клетками взрослого организма, более активной способностью к росту и размножению. При выращивании культур клеток необходимо выполнение ряда условий: 1) соблюдение правил асептики; 2) использование лабораторной посуды из нейтрального стекла (пробирки, флаконы, матрасы) или специальных реакторов для получения биотехнологической продукции; 3) использование сложных по составу питательных сред (среда 199, Игла), содержащих минеральные соли, аминокислоты, витамины, глюкозу, сыворотку крови животных или человека, буферные растворы для поддержания стабильного рН; 4) добавление антибиотиков к питательной среде для подавления роста посторонних микробов; 5) соблюдение оптимальной температуры (36— 38, 5 °С) роста клеток.
В зависимости от техники приготовления различают однослойные, суспензионные и органные культуры клеток: Однослойные культуры клеток — клетки способны прикрепляться и размножаться на поверхности химически нейтрального стекла лабораторной посуды в виде монослоя. Они получили наибольшее применение в вирусологии. Суспензионные культуры клеток — клетки размножаются во всем объеме питательной среды при постоянном ее перемешивании с помощью магнитной мешалки или во вращающемся барабане. Их используют для получения большого количества клеток, например, при промышленном получении вирусных вакцин. Органные культуры — цельные кусочки органов и тканей, сохраняющие исходную структуру вне организма (применяются ограниченно). Культуры клеток в процессе их культивирования способны проходить десятки генераций. По числу жизнеспособных генераций культуры клеток подразделяют на: 1) первичные, или первично-трипсинизированные; 2) перевиваемые, или стабильные; 3) полуперевиваемые. Первичные культуры способны размножаться только в первых генерациях, т. е. выдерживают не более 5—10 пассажей после выделения из тканей. В основе получения первичных культур лежит обработка кусочков тканей (эмбриональных, опухолевых или нормальных) протеолитическими ферментами, например трипсином, который разрушает межклеточные связи в тканях и органах с образованием изолированных клеток. Перевиваемые, или стабильные, культуры клеток способны размножаться в лабораторных условиях неопределенно длительный срок (десятки лет), т. е. выдерживают многочисленные пассажи. Их получают преимущественно из опухолевых или эмбриональных тканей, обладающих большой потенцией роста. Перевиваемые культуры клеток имеют преимущества перед первичными культурами. К ним относятся: продолжительность их культивирования, высокая скорость размножения опухолевых и эмбриональных клеток, меньшая трудоемкость, способность культур сохранять свои свойства в замороженном состоянии в течение многих лет, возможность использования международных линий культур во многих лабораториях мира. Однако злокачественный характер клеток и соматические мутации, претерпеваемые нормальными клетками в процессе многочисленных генераций, ограничивают использование этого вида культур, в частности невозможно их применение в производстве вирусных вакцин. Полуперевиваемые культуры клеток имеют ограниченную продолжительность жизни и выдерживают 40—50 пассажей. Их обычно получают из диплоидных клеток эмбриона человека. В процессе пассажей эти культуры сохраняют диплоидный набор хромосом, характерный для соматических клеток исходной ткани, и не претерпевают злокачественной трансформации. Поэтому полуперевиваемые культуры клеток могут быть использованы как в диагностике, так и в производстве вакцин. Штаммом диплоидных клеток называется морфологически однородная культура клеток, стабилизированная в процессе культивирования in vitro, имеющая ограниченный срок жизни, характеризующаяся тремя фазами роста (стабилизации, активного роста и старения), сохраняющая в процессе пассирования кариотип, свойственный исходной ткани, свободная от контаминантов и не обладающая онкогенной активностью при трансплантации хомячкам.
Внедрение в вирусологию метода культур клеток позволило выделить и идентифицировать многочисленные ранее неизвестные вирусы, так как почти к каждому вирусу можно подобрать соответствующие чувствительные клетки, в которых он способен репродуцироваться. Метод дал возможность изучать взаимодействие вирусов с клеткой на молекулярном уровне, получать высококачественные вакцинные и диагностические препараты, проводить вирусологические исследования в стандартных условиях.
|