Индикация вирусов

О продукции вирусов в организме животных судят по развитию у них видимых клинических проявлений заболевания, патологическим изменениям органов, и а также на основании реакции гемагглютинации (РГА) с суспензией из органов, содержащих вирусы.

Реакция гемагглютинации (РГА) основана на способности многих вирусов вызывать склеивание (агглютинацию) эритроцитов человека, птиц и млекопитающих в результате взаимодействия вирусных белков (гемагглютининов) с рецепторами эритроцитов. В результате РГА в пробирке образуется так называемый зонтик, который хорошо виден невоо­руженным глазом. При отсутствии вируса, эритроциты оседают на дно пробирок или лунок полистироловых пластинок, в которых ставят реа­кцию, в виде компактной " пуговицы". РГА используется для ориентировочного определения в исследуемом материале вируса. Чаще всего РГА используется в работе с вирусом гриппа.

О репродукции вирусов в культуре клеток, зараженных вируссодержащим материалом, можно судить на основании следующих фе­номенов:

цитопатогенного действия (ЦПД) вирусов, или цитопатического эффекта,

об­разования внутриклеточных включений;

об­разования «бляшек»;

реакций гемадсорбции и гемагглютинации;

«цветной» реакции,

реакции нейтрализации.

ЦПД — патологические изменения морфо­логии клеток, вплоть до их гибели, возника­ющие в результате репродукции вирусов, и наблюдаемые под микроскопом (рис. 3.11). В зависимости от особенностей репродуци­рующихся вирусов ЦПД может отличаться. В одних случаях быстро вакуолизируется цитоплазма, разрушаются митохондрии, округляются и гибнут клетки, а в других — формируются гигантские многоядерные клетки, называемые симпласты или наблюдается явление клеточной пролиферации, которое в итоге заканчивается деструкцией клеток. Таким образом, характер ЦПД позволяет использовать этот феномен не только для индикации присутствия вирусов, но и для их ориентировочной идентификации в культуре клеток.

Некоторые вирусы можно обнаружить и идентифицировать по внутриклеточным включениям, которые образуются в ядре или цитоп­лазме зараженных клеток. Часто включения представляют собой скопления вирусных частиц или отдельных компонентов вирусов, иногда могут содержать клеточный материал. Выявляют включения с помощью светового или люминесцентного микроско­па после окрашивания зараженных клеток соответственно анилиновыми красителями или флюорохромами. Включения могут отли­чаться по величине (от 0, 2 до 25 мкм), форме (округлые или неправильные) и численности (одиночные и множественные). Характерные цитоплазматические включения формируют­ся в клетках, инфицированных вирусом нату­ральной оспы (тельца Гварниери), бешенства (тельца Бабеша—Негри), а внутриядерные включения — при заражении аденовирусами или вирусами герпеса.

«Бляшки», или «негативные колонии», — пред­ставляют собой ограниченные участки разру­шенных вирусами клеток в сплошном монослое культур клеток. Они видны невооруженным гла­зом в виде светлых пятен на фоне окрашенного монослоя живых клеток. Добавление агара в питательную среду ограничивает рас­пространение вирусов по всему монослою после выхода их из разрушенной клетки и обеспечи­вает взаимодействие вирусов только с соседни­ми клетками. Каждая «бляшка» образуется по­томством одного вириона. Подсчитав количес­тво «бляшек», можно определить концентрацию вирусов в исследуемом материале. Кроме того, «бляшки» разных групп вирусов отличаются по размеру, форме, срокам появления. Поэтому ме­тод «бляшек» используют для дифференциации вирусов, а также для селекции штаммов и полу­чения чистых линий вирусов.

В основе реакции гемадсорбции (РГ_адс) лежит спо­собность культур клеток, инфицированных вирусами, адсорбировать на своей поверхности эритроциты, т.к. вирусы после репродукции выходят на поверхность клеток. Целый ряд вирусов (гриппа, па­рагриппа и др.) обладают гемадсорбирующими свойствами, что позволяет использовать реак­цию гемадсорбции для индикации этих виру­сов даже при отсутствии выраженного ЦПД в культуре клеток. Механизмы реакции гемад­сорбции и гемагглютинации сходны. Поэтому для обнаружения репродукции некоторых ви­русов в культуре клеток можно использовать реакцию гемагглютинации с культуральной жидкостью, т. е. с питательной средой, содер­жащей размножившиеся вирусы.

Следует заметить, что обе эти реакции (РГА и РГ_адс) не являются иммунологическими, поскольку они протекают без участия антител.

«Цвет­ная» реакция. О репродукции вирусов в культуре клеток можно также судить по так называемой «цвет­ной» реакции. Она регистрируется по измене­нию цвета индикатора, находящегося в пита­тельной среде для культур клеток. Если вирусы не размножаются в культуре клеток, то живые клетки в процессе своего метаболизма выде­ляют кислые продукты, изменяющие рН сре­ды и, соответственно, цвета индикатора. При репродукции вирусов нормальный метаболизм клеток нарушается (клетки гибнут), и среда сохраняет первоначальный цвет индикатора.

Реакция нейтрализации (РН). Основана на подавлении цитопатогенного эффекта (ЦПД) после смешивания со специфичными АТ. Для этого неизвестный вирус смешивают с известными коммерческими антисыворотками и после соответствующей инкубации вносят в монослой клеток. Отсутствие гибели клеток монослоя указывает на соответствие инфекционного агента и известных АТ. Это иммунологическая реакция.

В заключение этого раздела хочу подчеркнуть, что с помощью перечисленных способов можно только обнаружить вирусы в материале (индикация - обнаружение), но нельзя установить их видовую принадлежность. Для определения же вида вируса (идентификация) применяются серологические реакции, в которых используют­ся специфические, заведомо известные антитела.

Идентификация выделенных вирусов

Идентификацию вирусов проводят по следующим признакам:

вирусиндуцированным патологическим изменениям в чувстви­тельных живых системах;

антигенным свойствам вирусов в серологических реакциях с противовирусными видовыми и типовыми сыворотками (являет­ся основной и достаточно точной идентификацией);

выявлению вирусной НК, например, методом ПЦР;

результатам электронно-микроскопического изучения морфо­логии вирусов.