Питательные среды для выращивания гонококков

Эффективность бактериологического метода исследования в

значительной степени определяется качеством питательных сред. В

нашей стране наиболее широко апробированы и используются два вида

питательных сред: асцит-агар и безасцитные питательные среды.

Основой обеих сред является мясопентонный агар (МПА) из мяса

кроликов или свежих бычьих сердец. Методика его приготовления

заключается в следующем. Мясо кролика освобождают от жира и

сухожилий, пропускают через мясорубку или измельчают ножом,

взвешивают, заливают двойным объемом водопроводной воды и в таком

виде оставляют в холодильнике при 4ё на сутки для экстрагирования.

Затем массу нагревают до кипения, кипятят 10 минут, охлаждают и

фильтруют через марлю. К фильтрату добавляют 2% агар-агара, 1%

пептона и 0, 5% хлорида натрия, нагревают до растворения агар-агара

и устанавливают рН=7, 5-7, 6 (подщелачивание производят 20%

раствором едкого натрия). Среду доводят до кипения, фильтруют

через ватно-марлевый фильтр, разливают по стерильным флаконам или

колбам и стерилизуют в автоклаве 15-20 минут при 0, 5 атмосферы по

манометру (112ё).

Техника приготовления МПА из свежих бычьих сердец та же,

только кипячение массы измельченных сердец в воде следует

производить 20 минут вместо 10.

Возможно приготовление основы питательной среды без пептона.

При этом пользуются вышеизложенной методикой приготовления МПА, но

исключают из его состава пептон, измельченное мясо кролика кипятят

5 минут вместо 10 и стерилизуют среду в автоклаве в течение 10

минут при 0, 8 атмосферы по манометру (117ё).

Асцит-агар

Асцитическая жидкость должна быть получена от больных с

асцитом, причиной которого является сердечная недостаточность, и

не должна содержать желчных пигментов. Забор асцитической жидкости

производят через троакар в стерильную бутыль и добавляют к ней 5%

хлороформа для наркоза. В течение 10 дней жидкость перемешивают с

хлороформом путем вращения бутыли, затем ее оставляют при

комнатной температуре до полного оседания хлороформа на дно бутыли

и просветления жидкости. После этого по мере надобности прозрачную

асцитическую жидкость разливают по 50 мл в стерильные колбы с

ватными пробками и ежедневно в течение 3 дней их помещают в

водяную баню при температуре 56ё на 1 час для испарения хлороформа

через ватную пробку. После проверки асцитической жидкости на

стерильность она может быть использована для обогащения

питательной среды для выделения гонококка в концентрации 1/3 и 1/4

объема среды, что определяют опытным путем.

Рецепты безасцитных питательных сред

1. МПА из кроличьего мяса или свежих бычьих сердец

(рН=7, 4-7, 5) - 100 мл, гидролизат казеина для парентерального

белкового питания - 2 мл, дрожжевой аутолизат - 2 мл, сыворотка

крови крупного рогатого скота - 20 мл (среда КДС-1).

2. МПА из кроличьего мяса или свежих бычьих сердец

(рН=7, 4-7, 5) - 100 мл, 5% раствор гемогидролизата - 2 мл,

дрожжевой аутолизат - 2 мл, сыворотка крови крупного рогатого

скота - 20 мл (среда ГДС-2).

3. МПА из кроличьего мяса или свежих бычьих сердец

(рН=7, 4-7, 5) - 100 мл, среда 199 для культур тканей без

антибиотиков - 20 мл, дрожжевой аутолизат - 2 мл, сыворотка крови

крупного рогатого скота - 20 мл (среда 199-СДС).

4. МПА из кроличьего мяса или свежих бычьих сердец

(рН=7, 4-7, 5) - 100 мл, желток свежего куриного яйца - 10 мл,

сыворотка крови крупного рогатого скота - 20 мл (среда ЖС).

Яичный желток получают стерильно из диетических куриных яиц

непосредственно перед приготовлением среды. Для этого,

предварительно обработав спиртом, скорлупу вскрывают стерильным

пинцетом и содержимое яйца выливают в стерильную воронку. После

того как белок вытечет, оставшийся в воронке желток переносят в

стерильную посуду и мерной пипеткой берут необходимый для

изготовления питательной среды объем желтка.

Приготовление дрожжевого аутолизата заключается в следующем.

Пекарские дрожжи измельчают и закладывают в бутыль, превышающую по

объему взятые дрожжи в 4 - 5 раз, и оставляют для аутолиза на двое

суток в сушильном шкафу или термостате при 60ё. Затем густую

коричневую массу разбавляют тройным объемом теплой водопроводной

воды, хорошо перемешивают и дважды центрифугируют по 10 минут при

1000 оборотов в минуту (до просветления жидкости). Надосадочную

жидкость сливают, добавляют к ней 0, 5% хлористого натрия, доводят

рН до 7, 4-7, 5 и автоклавируют 30 минут при 1 атмосфере по

манометру (120ё). Хранят в мелкой расфасовке в холодильнике при

4ё.

Дрожжевой аутолизат может быть заменен 1, 5% раствором

экстракта кормовых дрожжей (ЭКД) в том же количестве (2 мл) 1, 5%

раствор ЭКД готовят в лаборатории из сухого ЭКД, растворяя его в

стерильной дистиллированной воде. Приготовленный таким образом

жидкий экстракт разливают по стерильным пробиркам и стерилизуют в

автоклаве при 0, 5 атмосферы по манометру в течение 20 минут.

Во всех вышеуказанных питательных средах сыворотка крови

крупного рогатого скота может быть заменена нормальной нативной

сывороткой для бактериологических питательных сред, которая

является той же самой сывороткой, но с добавлением консерванта.

Приготовление обогащенной среды

МПА, находящийся во флаконе или колбе, растапливают в водяной

бане, охлаждают до 56-58ё и добавляют к нему ингредиенты в

соотношениях, указанных ранее в рецептах. Обогащенный МПА по 3-3, 5

мл разливают в стерильные пробирки, среду скашивают и увлажняют

0, 5 мл стерильного мясопептонного бульона или изотонического

раствора хлорида натрия после того, как она застынет. Для проверки

на стерильность среду помещают в термостат при 35-37ё на сутки.

Все вышеуказанные безасцитные среды, кроме яичной, прозрачны,

на них легко дифференцировать колонии микроорганизмов. Среда,

обогащенная яйцом, отличается мутностью, она желтая, выросшие на

ней колонии, в частности, гонококки, плохо различимы. Однако рост

гонококка на этой среде обильный и его колонии легко могут быть

обнаружены путем обработки роста 1% раствором

диметилпарафенилендиамина или другого реактива на оксидазу,

который окрашивает колонии гонококка в красный цвет, хорошо

контрастирующий на желтом фоне среды. Использование желточной

среды без обработки роста микроорганизмов реактивом на оксидазу не

рекомендуется.

Качество каждой новой серии питательной среды лабораторного

изготовления необходимо проверять путем посева на нее

патологического материала от больных, у которых бактериоскопически

обнаружены гонококки.

Срок хранения МПА в холодильнике при 4ё не должен превышать 1

месяц, обогащенной среды - 7 суток.

В связи с тем, что для вышеуказанной среды возможен малый срок

хранения, разработана методика производственного изготовления

лиофилизированной безасцитной питательной среды, которая под

названием " Питательная среда для выделения гонококков, сухая"

выпускается в двух флаконах: часть I (основа среды) и часть II

(обогащающие вещества). Для приготовления рабочей среды в часть I

нужно добавить 100 мл стерильной дистиллированной воды и подогреть

в водяной бане при 100ё до полного растворения содержимого флакона

(в пределах 30 минут). Лишнее время выдерживать среду в водяной

бане не следует, т.к. это снижает ее качество. В часть II вносят

24 мл стерильной дистиллированной воды (растворение обогащающих

веществ наступает немедленно). Затем при соблюдении условий

стерильности часть II переносят в охлажденную до 56ё часть I,

смешивают, разливают по стерильным пробиркам, скашивают и

увлажняют как описано ранее.

Сухая среда готовится из кроличьего мяса или бычьих сердец,

помимо приведенных в рецепте 1 (среда КДС-1) обогащающих веществ

она содержит оротовую кислоту в концентрации 1 мкг/мл. Среда

высокого качества, удобна для использования в бактериологических

лабораториях, т.к. для перевода сухой среды в рабочую требуется

лишь стерильная дистиллированная вода.

Использование безасцитной питательной среды с добавлением

антибиотиков и оротовой кислоты дает хорошие результаты при

бактериологической диагностике, в том числе экстрагенительной

гонореи: гонореи миндалин и глотки, прямой кишки. Антибиотики

добавляют для подавления роста сопутствующей гонококку

бактериальной флоры, что повышает интенсивность роста гонококка,

облегчает обнаружение его единичных колоний и выделение в чистой

культуре. Добавляют 20, 0 ЕД/мл полимиксина М сульфата и 6, 2 ЕД/мл

ристомицина сульфата; вместо последнего можно использовать

линкомицин гидрохлорид - 2 мкг/мл. Оротовую кислоту вводят в

состав питательной среды в количестве 1 мкг/мл.

Для этого берут навеску оротовой кислоты 1 мг (1000 мкг) и

разводят в 1, 0 мл стерильной дистиллированной воды (получают

рабочий раствор, содержащий 1000 мкг который может сохраняться в

холодильнике в течение 10 дней) и стерилизуют в водяной бане 15

минут, затем отбирают 0, 1 мл полученного раствора и добавляют к

100 мл обогащенной питательной среды. Среду с антибиотиками

необходимо использовать одновременно со средой без антибиотиков

(одна пробирка со средой с антибиотиками, другая - без них), т.к.

хотя и редко, но встречаются штаммы гонококка, чувствительные к

вышеуказанным антибиотикам.

Среда сохранения (транспортировки)

Состав среды сохранения: 1) 1 литр дистиллированной воды,

свободной от хлора, 30 г агар-агара; 2) 900 мл дистиллированной

воды, свободной от хлора, 2 мл тиогликоловой кислоты, 12 мл 1М

раствора едкого натрия, 100 мл 20% водного раствора натрия

фосфорнокислого однозамещенного, 20 мл 1% раствора хлористого

кальция. Последнюю смесь (2) прибавляют к свежеприготовленному

агару (1), доводят рН до 7, 3-7, 4, по 10 мл среду разливают в

стерильные пробирки, стерилизуют текучим паром в течение 1 часа.

Ватные тампоны на деревянных палочках или стержнях из

нержавеющей стали диаметром около 2 мм, вмонтированные в ватные

пробки, кипятят 20 минут в фосфатном буфере, рН=7, 4, и

импрегнируют в течение 24 часов в 1% водной суспензии тонко

измельченного древесного угля. После высушивания ватные тампоны

подправляют, вставляют в бактериологические пробирки

соответствующего диаметра (равного диаметру пробирок со средой) и

стерилизуют в автоклаве 20 минут при 1 атмосфере (температура

120ё).

Для приготовления фосфатного буфера готовят два раствора: 1

раствор - в 1 л дистиллированной воды растворяют 28, 4 г натрия

фосфорнокислого двухзамещенного (0, 2М); 2 раствор - в 1 л

дистиллированной воды растворяют 27, 8 г лимонной кислоты (0, 1 М).

Смешивают 181, 7 мл 1 раствора и 18, 3 мл 2 раствора.

Производство посева с использованием среды сохранения

осуществляется следующим образом. Врач, осматривающий больного,

извлекает из пробирки тампон, вводит его в очаг заболевания на

несколько секунд для пропитывания (можно сделать несколько

движений по и против часовой стрелки), извлекает его, не касаясь

окружающих предметов, в пробирку со средой сохранения. Поверх

ватной пробки пробирку закрывают резиновой соской. До отправки

материала в бактериологическую лабораторию посевы сохраняют при 4ё

в холодильнике минимальный срок, но не более суток. Одновременно

берут патологический материал и делают мазки для

бактериоскопического исследования, которые направляют в

лабораторию вместе с посевом. В бактериологической лаборатории

немедленно после поступления тампоны с патологическим материалом

вынимают из среды сохранения и ими производят посев по поверхности

скошенной питательной среды в пробирках. Каждым тампоном делают

посев на питательную среду в двух пробирках. Посев по поверхности

питательной среды следует производить зигзагообразными движениями

вдоль поверхности среды, вращая тампон. Если диаметр пробирок со

средой сохранения и питательной средой аналогичен, можно тампон

после посева оставить во второй пробирке в соприкосновении с

питательной средой. Посевы помещают в термостат и выращивают при

36-37ё в эксикаторе. Следует иметь в виду, что при использовании

среды сохранения рост гонококка может наступить позже, чем при

непосредственном посеве патологического материала на питательную

среду.

Работа с культурами

Выращивание гонококков можно производить в пробирках или

чашках Петри; первый способ обеспечивает значительную экономию

среды. Для повышения процента высеваемости гонококков засеянные

питательные среды помещают в термостат в эксикаторе с 20%

содержанием углекислого газа, который получают в результате

реакции между серной кислотой и бикарбонатом натрия: в эксикатор

объемом 5 литров помещают стакан с 50 мл 10% серной кислоты, в