ПРИЛОЖЕНИЕ Б (обязательное). ИСО 4052-83 Кофе. Определение содержания кофеина (эталонный метод)

ПРИЛОЖЕНИЕ Б
(обязательное)

Кофе. Определение содержания кофеина (эталонный метод)

Введение

Описанный метод был выбран после сравнительного изучения нескольких альтернативных подходов: он отличается широтой сферы применения, воспроизводимостью результатов, специфичностью, легкостью использования и быстротой получения результатов.

Однако этот метод весьма чувствителен к условиям его применения, поэтому существенно, чтобы приводимые здесь инструкции выполнялись во всех деталях.

Б.1 Назначение и область применения

Настоящий международный стандарт устанавливает эталонный метод определения массовой доли кофеина в кофе.

Нижний предел прослеживаемой массовой доли кофеина составляет 0, 02% в пересчете на сухое вещество.

Б.2 Ссылки

ГОСТ 15113.0-77 Концентраты пищевые. Правила приемки, отбор и подготовка проб

ГОСТ 15113.4-77 Концентраты пищевые. Методы определения влаги

ИСО 3726-83 Кофе растворимый. Определение потери массы при 70 °С и пониженном давлении

Б.3 Сущность метода

Метод заключается в обработке кофе раствором аммиака с целью извлечения кофеина из пробы кофе, очистке кофеина чистым диэтилэфиром на двух колонках (первая - со щелочной средой, вторая - с кислой средой), извлечении кофеина чистым хлороформом из раствора диэтилового эфира и определении его массовой доли спектрофотометрическим методом.

Б.4 Реактивы

Все реактивы должны быть удостоверяемого аналитического качества. Применяемая вода должна быть дистиллированной или, по крайней мере, иметь соответствующую чистоту.

Б.4.1 Серная кислота. Раствор массовой концентрации 200 г/дм [молярной концентрации (H SO )=2 моль/дм ].

Б.4.2 Едкий натр. Раствор массовой концентрации 80 г/дм [молярной концентрации (NaOH)=2 моль/дм ].

Б.4.3 Диатомовая земля

Использование этого материала обеспечивает извлечение не менее 98% кофеина, содержащегося в анализируемой пробе.

Примечание - Подходящим материалом является Celite 545.

Б.4.4 Аммиак. Раствор массовой концентрации 70 г/дм (одна часть концентрированного раствора аммиака 0, 9 г/см + две части воды).

Б.4.5 Диэтиловый эфир чистый или повторно очищенный (Б.7.3) хроматографическим способом и насыщенный водой.

Для хроматографической очистки пропускают 800 см диэтилового эфира через хроматографическую колонку, содержащую 100 г основной окиси алюминия 1-го класса активности. Повторно очищенный таким образом диэтиловый эфир до использования должен содержаться в темных бутылях.

Примечание - Вместо повторно очищенного хроматографическим способом материала может применяться недавно перегнанный и свободный от пероксидов диэтиловый эфир.

Б.4.6 Кофеин [1, 3, 7-триметил-2, 6-диоксопурин (C H O N H O)], чистый безводный.

Б.4.7 Хлороформ чистый или повторно очищенный (Б.7.3) хроматографическим способом, как это описано в Б.4.5, и насыщенный водой.

Б.5 Аппаратура

Б.5.1 Хроматографические колонки (см. рисунок Б.1) длиной 250 мм, внутренним диаметром 21 мм (колонка 1) и 17 мм (колонка 2), с кранами, предпочтительно из политетрафторэтилена (ПТФЭ).

Б.5.2 Спектрофотометр с диапазоном измерения, позволяющим производить исследования при длине волны 276 нм (с точностью до 0, 004 единиц оптической плотности в рамках используемого диапазона) с допускаемой абсолютной погрешностью измерения не более 1%.

Б.5.3 Кюветы кварцевые толщиной поглощающего свет слоя 1 см.

Б.5.4 Обычное лабораторное оборудование, включая:

Б.5.4.1 химические стаканы вместимостью 100 см ;

Б.5.4.2 баню водяную;

Б.5.4.3 мерные колбы с одной меткой вместимостью 50, 100 и 1000 см ;

Б.5.4.4 пипетки вместимостью 2 и 5 см с одной меткой;

Б.5.4.5 весы лабораторные по ГОСТ 24104 с НПВ 200 г 2-го класса точности.

Б.6 Отбор проб

Отбор проб - по ГОСТ 15113.0.

Б.7 Проведение анализа

Б.7.1 Подготовка анализируемого образца

Б.7.1.1 Рассчитывают массовую долю сухого вещества в анализируемом образце после определения массовой доли влаги - по ГОСТ 15113.4 или ИСО 3726.

Б.7.1.2 Навеску натурального растворимого кофе массой (0, 500±0, 001) г помещают в химический стакан вместимостью 100 см (Б.5.4.1), добавляют 5 см раствора аммиака (Б.4.4) и помещают в кипящую водяную баню (Б.5.4.2) на 2 мин. После охлаждения раствор количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см (Б.5.4.3) и дистиллированной водой доводят объем до метки, тщательно перемешивают и охлаждают до комнатной температуры. С помощью пипетки (Б.5.4.4) отбирают 2 см полученного раствора, помещают в химический стакан вместимостью 100 см (Б.5.4.1), добавляют 3 г диатомовой земли (Б.4.3) и тщательно перемешивают.

Б.7.1.3 Навеску декофеинизированного растворимого кофе массой (0, 500±0, 001) г помещают в химический стакан вместимостью 100 см (Б.5.4.1), добавляют 5 см раствора аммиака (Б.4.4) и помещают в кипящую водяную баню (Б.5.4.2) на 2 мин. Добавляют 6 г диатомовой земли (Б.4.3) и тщательно перемешивают.

Б.7.2 Определение массовой доли кофеина

Б.7.2.1 Заполнение колонок

Б.7.2.1.1 Колонка 1 (щелочная) (рисунок Б.1)

Тщательно перемешивают 3 г диатомовой земли (Б.4.3) с 2 см раствора едкого натра (Б.4.2) до получения однородной смеси. (Материал для заполнения колонки может быть подготовлен заранее и храниться в закрытых емкостях. Для каждой щелочной колонки требуется 5, 16 г смеси). Полученный влажный порошок переносят частями, примерно по 2 г, в хроматографичсскую колонку диаметром 21 мм (Б.5.1), нижняя часть которой заполнена набивкой их хлопковой ваты или стекловаты. Без особого усилия уплотняют смесь после каждого добавления материала, применяя для этого стеклянную палочку, до образования однородного и плотного слоя.

Переносят в щелочную колонку слой смеси, подготовленной по Б.7.1.2 или Б.7.1.3. Для исключения потерь кофеина химический стакан дважды очищают порциями диатомовой земли по 1 г и также помещают в щелочную колонку. Поверх кладут слой хлопковой ваты или стекловаты.

Б.7.2.1.2 Колонка 2 (кислотная) (рисунок Б.1)

Рисунок Б.1 - Колонки для определения массовой доли кофеина

1 - колонка 1 (щелочная) длиной 250 мм; 2 - хлопковая вата или стекловата; 3 - смесь диатомовой земли и анализируемого образца; 4 - 3 г диатомовой земли и 2 см NaOH (5, 16 г); 5 - хлопковая вата или стекловата; 6 - кран, предпочтительно из политетрафторэтилена; 7 - колонка 2 (кислотная) длиной 250 мм; 8 - стекловата; 9 - 3 г диатомовой земли и 3 см H SO (6, 36 г)

Рисунок Б.1 - Колонки для определения массовой доли кофеина

Тщательно перемешивают 3 г диатомовой земли (Б.4.3) с 3 см раствора серной кислоты (Б.4.1) до получения однородной смеси. (Материал для заполнения колонки может быть подготовлен заранее и храниться в закрытых емкостях. Для каждой кислотной колонки требуется 6, 36 г смеси). Полученный влажный порошок переносят частями, примерно по 3 г, в хроматографическую колонку диаметром 17 мм (Б.5.1), нижняя часть которой заполнена набивкой из стекловаты. Без особого усилия уплотняют смесь после каждого добавления материала, применяя для этого стеклянную палочку, до образования однородного и плотного слоя. Поверх кладут слой стекловаты.

Б.7.2.1.3 Очистка и извлечение кофеина

Устанавливают колонки одну над другой так, чтобы жидкость из щелочной колонки прямо стекала в кислотную колонку. Пропускают постепенно 150 см диэтилового эфира (Б.4.5) через обе колонки.

Кран колонки 2 регулируют так, чтобы на поверхности содержимого в колонке остался тонкий слой жидкости. После этого колонку 1 убирают, а через колонку 2 пропускают еще 50 см диэтилового эфира. Вытекающую из колонки 2 жидкость сливают в отходы. (Используемый диэтиловый эфир может быть восстановлен взбалтыванием его с сернокислым железом).

Избыточное количество диэтилового эфира удаляют с помощью вакуум-насоса или резиновой груши до тех пор, пока не прекратится стекание капель диэтилового эфира из колонки, и выходящий из крана воздух не будет нести лишь слабый запах диэтилового эфира.

Для извлечения кофеина через колонку 2 пропускают 45-50 см хлороформа (Б.4.7), который собирают в мерную колбу вместимостью 50 см с одной меткой (Б.5.4.3), и доводят объем до метки хлороформом. Полученную смесь тщательно перемешивают.

Краны колонок регулируют так, чтобы скорость жидкости (хлороформа и диэтилового эфира) не превышала 3 см /мин и обеспечивала равномерное прохождение жидкости через все содержимое колонок.

Во избежание вдыхания паров растворов диэтилового эфира и хлороформа и возможности взрыва их добавление должно проводиться в хорошо вентилируемом вытяжном шкафу.

Б.7.2.2 Спектрометрические измерения

Б.7.2.2.1 Спектрометрическое измерение анализируемого раствора

На спектрофотометре (Б.5.2) измеряют оптическую плотность полученного раствора в кварцевой кювете (Б.5.3) по отношению к чистому насыщенному водой хлороформу при длине волны 276 нм, соответствующей максимуму спектра поглощения кофеина, и при длинах волн на 30 нм выше и ниже этого значения - для подтверждения чистоты полученного кофеина.

Если максимальная оптическая плотность превышает предел измерений используемого прибора, необходимо повторить измерение на разбавленном растворе кофеина в хлороформе. Проведенное разбавление необходимо учитывать при расчете содержания кофеина (раздел 8). Если максимальная измеренная оптическая плотность менее 0, 2, следует повторить анализ, используя большую навеску анализируемого образца натурального растворимого кофе.

Б.7.2.2.2 Подготовка и спектрометрическое измерение контрольного раствора

Навеску чистого кофеина (Б.4.6) массой (0, 100±0, 001) г помещают в мерную колбу с одной меткой вместимостью 1000 см (Б.5.4.3), растворяют в хлороформе и доводят до метки. Пипеткой (Б.5.4.4) отбирают 5, 0 см полученного раствора, помещают в мерную колбу с одной меткой вместимостью 50 см (Б.5.4.3) и доводят хлороформом до метки.

Измеряют оптическую плотность полученного раствора согласно Б.7.2.2.1. Скорректированная оптическая плотность контрольного раствора (раздел 8) должна быть около 0, 4.

Б.7.3 Контрольный анализ

Контрольный анализ проводят на реактивах, используя описанную выше процедуру, но без анализируемого образца.

Перед использованием повторно очищенных хроматографическим способом реактивов (Б.4.5 и Б.4.7) повторяют контрольный анализ для оценки их чистоты.

Б.8 Правила обработки результатов анализа

Б.8.1 Массовую долю кофеина , %, в пересчете на сухое вещество вычисляют по формуле

. (Б.1)

Для декофеинизированного растворимого кофе формула Б.1 имеет вид:

,

где - массовая концентрация кофеина в контрольном растворе (рассчитывают по Б.7.2.2.2), г/дм ;

- скорректированная оптическая плотность очищенного экстракта:

; (Б.2)

- длина волны, соответствующая максимуму спектра поглощения кофеина, (276 нм);

- скорректированная оптическая плотность контрольного раствора кофеина:

; (Б.3)

- масса анализируемого образца натурального растворимого кофе, г;

- массовая доля сухого вещества, % (Б.7.1.1).

Б.8.2 Требования к точности результатов измерений

Б.8.2.1 За окончательный результат анализа принимают среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений, допускаемое абсолютное расхождение между которыми при Р=0, 95 не должно превышать:

- 0, 17% для натурального растворимого кофе массовой долей кофеина (4, 0±0, 4)%;

- 0, 12% для натурального растворимого кофе массовой долей кофеина (2, 0±0, 2)%;

- 0, 01% для декофеинизированного растворимого кофе массовой долей кофеина не более 0, 3%.

Допускаемое абсолютное расхождение между результатами двух параллельных определений для натурального растворимого кофе массовой долей кофеина в интервалах от 0, 3% до 1, 8% и от 2, 2% до 3, 6% определяют методом линейной интерполяции.

Б.8.2.2 Абсолютное расхождение между результатами двух измерений (проведенных в двух различных лабораториях) при
0, 95 не должно превышать:

- 0, 39% для натурального растворимого кофе массовой долей кофеина (4, 0±0, 4)%;

- 0, 2% для натурального растворимого кофе массовой долей кофеина (2, 0±0, 2)%;

- 0, 01% для декофеинизированного растворимого кофе массовой долей кофеина не более 0, 3%.

Абсолютное расхождение между результатами двух измерений (проведенных в двух различных лабораториях) для натурального растворимого кофе массовой долей кофеина в интервалах от 0, 3% до 1, 8% и от 2, 2% до 3, 6% определяют методом линейной интерполяции.



Текст документа сверен по:
официальное издание
М.: ИПК Издательство стандартов, 2002