Введение. Часть I. Фармацевтический анализ

Часть I. Фармацевтический анализ

По функциональным группам

Введение

Лекарственные вещества (ЛВ) органического происхождения составляют большую часть лекарственных средств. Анализ этих ЛВ, в основном, сводится к исследованию функциональных групп, входящих в состав соединения.

Функциональная группа (ФГ) – это реакционно-способный атом или группа атомов, обусловливающие химические свойства вещества, его фармакологическую активность, а также принадлежность к определённому классу органических соединений. Анализ лекарственных веществ по ФГ позволяет унифицировать методики реакций подлинности и количественного определения; даёт возможность прогнозировать способы испытаний по их структуре.

ЛВ, как правило, полифункциональные соединения, т.е. содержат несколько ФГ. При испытании на подлинность обычно выполняют реакции на все ФГ соединения, что позволяет достоверно идентифицировать исследуемое ЛВ. Для каждой ФГ предложено несколько способов количественного определения, что даёт возможность выбрать оптимальный метод анализа при исследовании ЛВ в различных объектах (субстанция, лекарственный препарат).

Некоторые ФГ обладают одинаковыми химическими свойствами, например, карбоксильная и имидная, сложноэфирная и амидная, ковалентно связанные хлор и бром. Поэтому, при действии на ЛВ реагента эти группы вступают в реакцию одновременно, что следует учитывать при проведении анализа соединения.

Классификация ФГ основана на названии входящих в них элементов. Однако, она условна, т.к. некоторые ФГ являются смешанными (содержат несколько элементов).

1. ФГ, содержащие кислород:

гидроксильная группа (спиртовая или фенольная);

карбонильная (альдегидная или кетонная);

a-кетольная;

карбоксильная группа;

сложноэфирная группа;

простая эфирная группа.

2. ФГ, содержащие азот:

3. Прочие ФГ (которые нельзя обобщить по одному признаку):

Анализ лекарственных веществ по ФГ

Спиртовый гидроксил

(1) (2) (3)

Гидроксил, связанный с алифатическим (примеры 1 и 2) или алициклическим (3) углеводородным радикалом. Различают первичный (1), вторичный (3) и третичный (2) спиртовый гидроксил.

Химические свойства

1. Реакция образования сложных эфиров (реакция этерификации). В реакцию вступают все спиртовые гидроксилы.

2. Окислительно-восстановительные. Спирты проявляют слабые восстановительные свойства. Окисляются только сильными окислителями (K₂Cr₂O₇, KMnO₄, HIO₄, KIO₄) в кислой среде. Механизм реакции окисления различен, зависит от характера гидроксила.

Третичные и многоатомные спирты окисляются трудно, с разрывом углеводородной цепи.

3. Кислотно-основные. Очень слабые кислотные свойства, солей с щелочами не образуют. На силу кислотных свойств влияют характер заместителя в радикале и число гидроксильных групп в соединении: с увеличением числа групп кислотные свойства возрастают. Многоатомные спирты вследствие этого способны образовывать внутрикомплексные (хелатные) соединения с солями металлов (медь, кобальт) в сильнощелочной среде. Наибольший интерес представляет реакция с меди (II) сульфатом в среде натрия гидроксида. Одноатомные спирты вступают в реакцию комплексообразования, если кроме спиртового гидроксила содержат другие электронодонорные группы, способные образовывать координационные связи с металлом.

Реакции подлинности

1. Реакция образования сложных эфиров. Спирты образуют с органическими кислотами или ангидридами кислот в присутствии водоотнимающих средств сложные эфиры. Сложные эфиры, полученные на основе низкомолекулярных спиртов, обладают характерным запахом, а сложные эфиры на основе высокомолекулярных спиртов являются кристаллическими веществами, имеющими четкую температуру плавления.

1.1.

Методика. К I мл этанола прибавляют 5 капель ледяной уксусной кис-

лоты, 0, 5 мл конц. серной кислоты и осторожно нагревают; обнаруживается характерный запах этилацетата (свежих яблок).

1.2. Реакция ацилирования (ацетилирования).

2. Реакция окисления спиртов до альдегидов. Образующиеся альдегиды обнаруживают по запаху. В качестве окислителей используют калия гексациано -(III)-феррат, калия перманганат, калия дихромат и др.

2.1.

Методика. Около 0, 01 г эфедрина гидрохлорида растворяют в 0, 5 мл воды,

прибавляют кристаллик калия гексацано-(III)-феррата и нагревают до кипения, появляется запах бензальдегида.

2.2. В случае кальция лактата одновременно протекает реакция декарбоксилирования.

Методика. Около 0, 05 г кальция лактата растворяют в 1 мл воды, подкисляют разведённой серной кислотой, прибавляют раствор калия перманганата до красно-фиолетового окрашивания и нагревают; обнаруживается запах ацетальдегида.

3. Реакция образования комплексных соединений.

3.1. Многоатомные спирты.

3.1.1.

Методика. К 0, 5 мл глицерола (глицерина) прибавляют по 5 капель растворов натрия гидроксида и меди (II) сульфата, появляется интенсивное синее окрашивание.

3.1.2.

Методика. К нескольким крупинкам левомицетина прибавляют 3 капли раствора меди (II) сульфата и 0, 5 мл раствора натрия гидроксида, через 1 минуту взбалтывают с 0, 5 мл н-бутанола. Слой н-бутанола окрашивается в сине-фиолетовый цвет.

3.2. Одноатомные спирты.

Методика. 0, 01 г эфедрина гидрохлорида растворяют в 1 мл воды, прибавляют 2 капли раствора меди (II) сульфата, 10-15 капель раствора натрия гидроксида и 1 мл эфира; при взбалтывании слой органического растворителя окраши­вается в красно-фиолетовый цвет; водный слой – в синий.

Количественное определение

1. Метод ацетилирования (для высокомолекулярных спиртов). Основан на свойстве спиртов вступать в реакцию ацетилирования с уксусным ангидридом с образованием нерастворимых сложных эфиров и выделением эквивалентного количества уксусной кислоты. Выделившуюся уксусную кислоту оттитровывают раствором натрия гидроксида (индикатор - фенолфталеин).

Избыток уксусного ангидрида при разбавлении водой подвергают гидролизу с образованием уксусной кислоты, которая тоже будет титроваться щёлочью, поэтому параллельно проводят контрольный опыт.

При расчёте из избытка щёлочи, израсходованного на контрольный опыт, вычитают объём щёлочи, израсходованный на определение:

V_NaOH(контрольный опыт) - V_NaOH(на определение)

f_{экв (вещества)}=1/n, где n – количество спиртовых гидроксилов в молекуле вещества. f_{экв (ментола)}=1.

2. Перйодатный метод (для многоатомных спиртов). Основан на свойстве многоатомных спиртов окисляться йодной кислотой в кислой среде с образованием формальдегида и муравьиной кислоты по общей схеме:

При окислении двух групп образуются две молекулы формальдегида, на что расходуется одна молекула йодной кислоты, а из группы получается муравьиная кислота, для образования которой требуется также одна молекула йодной кислоты. Избыток йодной кислоты определяют йодометрическим методом: прибавляют раствор калия йодида и выделившийся йод титруют раствором натрия тиосульфата (индикатор крахмал). Параллельно проводят контрольный опыт. При титровании раствора после окисления, наряду с не вошедшим в реакцию перйодатом, определяется также образовавшийся йодат:

Реакция среды должна быть кислая, чтобы не окислился йодом выделившийся формальдегид. В расчётах учитывают количество раствора натрия тиосульфата, израсходованное на определение и контрольный опыт: V_{натр. тиосульфата} (контр. опыт) - V_{натр. тиосульфата} (на определение спирта).

Фактор эквивалентности зависит от числа гидроксильных групп в молекуле спирта. Расчёт проводится косвенным способом, по изменению степени окисления реагента. Каждая молекула реагента в ходе реакции принимает два электрона .

1 молекула спирта ¾ (n+1) молекул ® (n+1) молекул

f_{экв (спирта)}=1/2(n+1), где n – число групп в молекуле спирта.

3. Куприметрический метод. Основанна свойстве спиртов образовывать с меди (II) сульфатом в щелочной среде устойчивые комплексные соединения (прямое титрование, индикатор – мурексид). Метод используется при внутриаптечном контроле препаратов хлорамфеникола (левомицетина).

f_{экв (хлорамфеникола)}= 2

Фенольный гидроксил

Гидроксил, связанный с ароматическим циклом.

Химические свойства

1. Реакция этерификации (аналогично спиртовому гидроксилу).

2. Окислительно-восстановительные. Фенолы проявляют сильные восстановительные свойства, очень легко окисляется даже слабыми окислителями. Образуются окрашенные соединения хиноидной структуры.

3. Кислотно-основные. Электронная пара гидроксила смещена в сторону ароматического цикла, поэтому кислотные свойства более сильные, чем у спиртов (рК_а фенола 9, 89). Образуют соли со щелочами (при рН ~ 12-13), комплексные соединения с железа (III) хлоридом (в нейтральных, слабощелочных, кислых растворах).

4. Реакции электрофильного замещения атома водорода в ароматическом кольце (бромирования, конденсации с альдегидами, сочетания с солями диазония, нитрования, нитрозирования, йодирования и др.) Способность фенолов вступать в реакции электрофильного замещения объясняется взаимодействием неподелённой электронной пары атома кислорода с p - электронами бензольного кольца. Электронная плотность смещается в сторону ароматического кольца. Наибольший избыток электронной плотности наблюдается у атомов углерода в о- и п- положениях по отношению к фенольному гидроксилу (ориентанту 1 рода).

Реакции подлинности

Методика. К 0, 25 г гексэстрола (синэстрола) прибавляют 1 мл уксусного ангидрида и 2 мл безводного пиридина. Кипятят с обратным холодильником 15 минут, охлаждают, добавляют 50 мл воды и тщательно встряхивают. Осадок отфильтровывают, промывают водой, сушат при 100-105° и определяют температуру плавления. Температура плавления выделенного диацетата синэстрола 137-139°С.

2. Реакции окисления. Примером реакции окисления является индофеноловая проба. Проба проводится в растворе аммиака при взаимодействии с такими окислителями, как хлорамин, хлорная известь, бромная вода.

Методика. 0, 05 лекарственного вещества (фенола, тимола, резорцина) растворяют в 0, 5 мл раствора аммиака и добавляют 3-4 капли раствора хлорамина, нагревают смесь на кипящей водяной бане. Через несколько минут появляется окрашивание, изменяющееся при добавлении кислот. Фенол образует сине-зелёное окрашивание, переходящее при добавлении кислот в красное; тимол – слабо-розовое, переходящее в жёлтое; резорцин – буровато-желтое, переходящее в красное.

3. Реакция комплексообразования с ионами железа (III). В зависимости от количества фенольных гидроксилов, наличия в молекуле фенола других функциональных групп, их взаимного расположения, рН среды, температуры, образуются комплексные соединения различного состава и окраски (исключение составляет тимол). Фенол даёт синее окрашивание, резорцин ­- сине-фиолетовое, кислота салициловая - сине-фиолетовое или красно-фиолетовое, осалмид (оксафенамид) и натрия пара-аминосалицилат - красно-фиолетовое, хинозол - синевато-зелёное. Реакция является фармакопейной для большинства фенольных соединений.

Методика. К 1 мл водного раствора (1: 100) фенола, резорцина, хинозола, натрия пара-аминосалицилата, натрия салицилата, спиртового раствора парацетамола, осалмида (оксафенамида), кислоты салициловой прибавляют 2 капли раствора железа (III) хлорида; наблюдают эффект реакции.

4. Реакции электрофильного замещения.

4.1. Реакция бромирования. При бромировании бромной водой образуются белые или желтые осадки бромпроизводных.

При наличии заместителей в о- и п-положениях ароматического кольца в реакцию вступают незамещённые атомы водорода ароматического кольца:

Если в о- и п-положениях по отношению к фенольному гидроксилу находится карбоксильная группа, то при действии избытка брома происходит декарбоксилирование:

Если соединение содержит два фенольных гидроксила в м-положении, то при действии брома образуются трибромпроизводные (согласованная ориентация):

Если две гидроксильные группы расположены по отношению друг к другу в о- или п-положениях, то реакция бромирования не протекает (несогласованная ориентация):

Методика. К водному или спиртовому раствору (1: 100-1: 200) натрия салицилата, натрия пара-аминосалицилата, резорцина, тимола, хинозола прибавляют несколько капель бромной воды и разведённой серной кислоты; образуются осадки бромпроизводных.

4.2. Реакция нитрозирования (нитрозореакция Либермана). Реакция характерна для фенолов, не имеющих заместителей в о- или п- положениях. При действии нитрита натрия в кислой среде образуется п-нитрозофенол, изомеризующийся в монооксим п- бензохинона, который, реагируя с избытком фенола в кислой среде, даёт индофенол. Реакцию нитрозирования можно рассматривать как разновидность индофеноловой реакции (см. «Фенолы», п.2).

Методика. 0, 01 г фенола, тимола, резорцина, гексэстрола (синэстрола) помещают на предметное стекло, смачивают 2-3 каплями 1% раствора натрия нитрита в концентрированной серной кислоте. Наблюдается окрашивание, изменяющееся при добавлении раствора щёлочи. Фенол образует тёмно-зелёное окрашивание, переходящее в вишнёво-красное; тимол - сине-зелёное, переходящее в фиолетовое; резорцин - фиолетово-чёрное, переходящее в фиолетовое; гексэстрол (синэстрол) - красно-фиолетовое, переходящее в вишнёвое.

4.3. Реакция нитрования. Фенолы вступают в реакцию с разведённой азотной кислотой при комнатной температуре с образованием о- и п- нитропроизводных. Добавление раствора натрия гидроксида усиливает окраску вследствие образования хорошо диссоциируемой соли:

Методика. К 0, 001 г лекарственного вещества (фенола, тимола, резорцина), растворённого в 2 мл воды или в 2 мл 95% спирта (синэстрол), добавляют 1-2 мл разведённой азотной кислоты и нагревают на водяной бане. Постепенно появляется жёлтое окрашивание.

4.4. Реакция азосочетания фенолов с солью диазония в щелочной среде. При взаимодействии фенолов с солью диазония при рН 9-10 образуются азокрасители, окрашенные в жёлто-оранжевый или красный цвет. Реакция азосочетания протекает в о- и п- положениях по отношению к фенольному гидроксилу. В качестве диазореактива обычно применяют диазотированную сульфаниловую кислоту.

Методика. К 1мл водного раствора (1: 100) натрия салицилата, хинозола, натрия пара-аминосалицилата, резорцина; спиртового раствора кислоты салициловой, гексэстрола (синэстрола) добавляют 0, 5 мл раствора аммиака и 4 капли диазореактива - наблюдается красное или оранжево-красное окрашивание.

4.5. Реакции конденсации с альдегидами.

4.5.1. Реакция с реактивом Марки. При нагревании фенолов с раствором формальдегида в присутствии концентрированной серной кислоты образуются бесцветные продукты конденсации, при окислении которых получаются интенсивно окрашенные соединения хиноидной структуры. Серная кислота играет в данной реакции роль дегидратирующего, конденсирующего средства и окислителя.

Методика. Около 0, 02 г лекарственного вещества (резорцина, кислоты салициловой, кислоты ацетилсалициловой) помещают в фарфоровую чашку, прибавляют 1 каплю формалина и 2-3 капли концентрированной серной кислоты. При стоянии или после лёгкого нагревания образуется красное окрашивание.

4.5.2. Реакция с хлороформом в щелочной среде. При нагревании фенолов с хлороформом в щелочной среде образуются аурины – трифенилметановые красители. Реакция является фармакопейной на тимол.

Методика. 0, 2 г тимола или резорцина нагревают на водяной бане с 1 мл раствора натрия гидроксида. К подогретому раствору прибавляют 2-3 капли хлороформа и взбалтывают; появляется красно- фиолетовое окрашивание.

Количественное определение

1. Методы галогенирования. Основаны на реакции электрофильного замещения атомов водорода ароматического кольца на атомы галогена.

1.1. Броматометрический метод.

1.1.1. Прямое титрование раствором калия бромата в присутствии калия бромида (индикатор метиловый оранжевый или метиловый красный). В точке эквивалентности избыточная капля калия бромата образует бром, который необратимо окисляет индикатор и происходит обесцвечивание раствора. Метод является фармакопейным для тимола.

f_{экв (тимола)}=1/4, т.к. 1 молекула тимола взаимодействует с двумя молекулами брома, которые соответствуют 4 экв.

В общем виде: f_{экв (вещества)}=1/n, где n – число атомов галогена, реагирующих с одной молекулой вещества.

1.1.2. Обратное титрование. К лекарственному веществу добавляют избыток титрованного раствора калия бромата и калия бромид, раствор подкисляют серной или хлороводородной кислотой. Образующийся бром вступает в реакцию электрофильного замещения с фенолом. Через 10-15 минут избыток брома определяют йодометрическим методом: добавляют калия йодид

и выделившийся йод титруют раствором натрия тиосульфата (индикатор - крахмал). Иногда вместо крахмала применяют хлороформ – в этом случае титруют при сильном взбалтывании раствора до обесцвечивания хлороформного слоя. Обратное титрование используется, согласно ФС, для определения фенола, кислоты салициловой, раствора гексэстрола (синэстрола) в масле для инъекций.

f_{экв (резорцина, фенола, кислоты салициловой)}=1/6; f_{экв (гексэстрола)}=1/8.

1.2. Йодометрический метод (прямое и обратное титрование). Т.к. реакция йодирования является обратимой, определение проводят в присутствии натрия гидрокарбоната или натрия ацетата для связывания выделяющегося йодоводорода.

f_{экв (фенола)}=1/ 6

При прямом титровании титруют до синего окрашивания, при обратном - избыток йода оттитровывают раствором натрия тиосульфата до обесцвечивания (индикатор - крахмал).

1.3. Йодхлорметрический метод (обратное титрование). При взаимодействии фенолов с йодмонохлоридом образуются йодпроизводные фенолов. Избыток йодмонохлорида определяют йодометрическим методом: прибавляют калия йодид и выделившийся йод титруют раствором натрия тиосульфата (индикатор крахмал). Йодмонохлорид, в отличие от брома, на вытесняет карбоксильную группу, находящуюся в о- и п- положениях по отношению к фенольному гидроксилу.

f_{экв (кислоты салициловой)}=1/4

2. Метод ацетилирования. Основан на свойстве фенолов образовывать при взаимодействии с уксусным ангидридом нерастворимые сложные эфиры.

Метод является фармакопейным для гексэстрола (синэстрола). Условия определения и способы расчёта указаны в методах количественного определения спиртов (п.1).

3. Фотоколориметрический и спектрофотометрический методы с использованием цветных реакций (комплексообразования с железа (III) хлоридом, азосочетания с солями диазония и др.)

Карбонильная (альдегидная и кетонная) группа

(1) (2) (3)

Альдегидная группа, связанная с алифатическим (пример 1), алициклическим (пример 2) или ароматическим (3) радикалом.

(1) (2) (3)

Кетонная группа, связанная с алифатическим (пример 1), алициклическим (пример 2) или ароматическим (3) радикалом.

Химические свойства

Соединения, содержащие карбонильную группу, являются очень реакционноспособными соединениями. Это объясняется частичной поляризацией p - связи между атомами углерода и кислорода, смещением электронной плотности углерода к кислороду и возникновением на нём дробного отрицательного заряда. На карбонильном углероде имеется дробный положительный заряд и частично вакантная орбиталь.

1. Окислительно-восстановительные свойства. Альдегиды проявляют достаточно сильные восстановительные свойства в щелочной среде,

Кетоны – устойчивые соединения, в обычных условиях не окисляются.

2. Реакция замещения кислорода карбонильной группы. На атоме углерода расположен центр электрофильности. Альдегиды и кетоны реагируют с нуклеофильными реагентами. Наибольший интерес представляют реакции с аминами, в ходе которых образуются основания Шиффа. Альдегиды, кроме того, вступают в реакции конденсации с фенолами.

3. Реакции присоединения к карбонилу альдегидной группы (кетоны не реагируют). В анализе альдегидов нашла применение реакция присоединения гидросульфита (бисульфита) натрия.

Реакции подлинности

1. Реакции окисления альдегидов. В качестве реагентов используют слабые окислители, например, оксиды и гидроксиды металлов: Ag⁺, Cu²⁺, Hg²⁺. В ходе реакции реактивы восстанавливаются до свободных металлов: Ag^о, Hg^о или Cu₂O, имеющих характерный внешний вид (цвет).

1.1. Реакция с аммиачным раствором серебра нитрата (реакция «серебряного зеркала»). Альдегиды восстанавливают [Ag(NH₃)₂]⁺ до металлического серебра.

Методика. К 1 мл раствора серебра нитрата прибавляют по каплям 10% раствор аммиака до растворения образующегося при постепенном приливании раствора аммиака осадка, затем прибавляют 2 –3 капли раствора альдегида: формалина, 5% раствора метенамина (гексаметилентетрамина), 10% раствора глюкозы; осторожно нагревают на водяной бане при температуре 50 –60⁰ С; выделяется металлическое серебро.

1.2. Реакция с реактивом Фелинга. Альдегиды восстанавливают соединения меди (II) до меди (I) оксида, образуется осадок, окрашенный в кирпично-красный цвет.

Методика. К 1 мл раствора, содержащего около 0, 01 – 0, 02 г лекарственного вещества (см. методику 1.1.), прибавляют 2 мл реактива Фелинга, нагревают до кипения; образуется кирпично-красный осадок.

1.3. Реакция с реактивом Несслера. Альдегиды восстанавливают [HgI₄]^2- до металлической ртути, выпадает осадок тёмно-серого цвета.

Методика. К 2 –3 каплям раствора альдегида (см. методику 1.1) прибавляют 2 –3 капли реактива Несслера и нагревают; образуется тёмно-серый осадок металлической ртути.

2. Реакции конденсации.

2.1. Реакции окислительной конденсации альдегидов с фенолами (см. Фенолы, 4.5.1). Реакция используется для подтверждения подлинности раствора формальдегида и лекарственных веществ, при гидролизе которых он выделяется: метенамин (гексаметилентетрамин), метамизол-натрий (анальгин), примидон (гексамидин). В качестве реактива используются салициловая или хромотроповая кислоты.

Реакцию конденсации формальдегида с салициловой кислотой см. «Фенолы», п. 4.5.1.

Методика. Около 0, 02 г метенамина (гексаметилентетрамина), метамизола-натрия (анальгина), примидона (гексамидина) помещают в фарфоровую чашку, прибавляют 0, 02 г салициловой или 2-3 капли 2% раствора динатриевой соли хромотроповой кислоты, 2-3 капли концентрированной серной кислоты и нагревают. Образуется красное или сиреневое окрашивание.

2.2. Реакции конденсации альдегидов и кетонов с аминами и гидразинами (гидроксиламином, фенилгидразином, 2, 4-динитрофенилгидразином и др.). Реакции конденсации применяются для определения подлинности как самих альдегидов и кетонов, так и веществ, вступающих во взаимодействие с ними. Реакции альдегидов с аминами протекают через стадию нуклеофильного присоединения.

Методика. 0, 05 г метандиенона (метандростенолона), кортизона ацетата, метилтестостерона, преднизолона, прогестерона растворяют в 3 мл этилового спирта, прибавляют 1мл раствора 2, 4-динитрофенилгидразина; образуется осадок или окрашивание.

Количественное определение

1. Йодометрический метод (обратное титрование). Используется для определения формальдегида, глюкозы. Основан на окислении альдегидов йодом в щелочной среде (NaOH) до натриевой соли соответствующей кислоты. После подкисления раствора избыток йода оттитровывают раствором натрия тиосульфата.

f_{экв (альдегида)}=1/2

2. Сульфитный метод. Основан на свойстве альдегидов взаимодействовать с натрия сульфитом в присутствии воды с выделением эквивалентного количества натрия гидроксида, которое титруют кислотой (индикатор - фенолфталеин). Метод используется, согласно ФС, для количественного определения формальдегида в препарате «Формидрон».

f_{экв (альдегида)}=1

3. Оксимный метод. Основан на свойстве альдегидов и кетонов образовывать с гидроксиламина гидрохлоридом оксимы с выделением эквивалентного количества хлороводородной кислоты. Выделившуюся кислоту титруют щёлочью (косвенное алкалиметрическое определение), либо осадок оксима отфильтровывают, промывают, высушивают до постоянной массы и взвешивают (гравиметрическое определение).

f_{экв (камфоры)}=1

4. Фотоколориметрический и спектрофотометрический методы с использованием цветных реакций (конденсация с фенолами, ароматическими аминами, гидразинами).