Методы получения воды очищенной

Ионный обмен

Используются колонки с ионообменными смолами, которые делятся на 2 группы.

Катиониты — смолы с кислой карбоксильной или сульфоновой группой, обменивают ионы водорода на ионы щелочных и щелочноземельных металлов;

Аниониты — в основном продукты полимеризации аминов с формальдегидом. Обменивают свои гидроксильные группы на анионы.

Используемые для деминерализации воды ионнообменные смолы являются прекрасным субстратом для размножения бактерий, поэтому данным методом нельзя пользоваться для получения воды для инъекций.

Принцип обратного осмоса

Основан на использовании полупроницаемых мембран. Эти мембраны удерживают до 100% взвешенных коллоидных и растворенных веществ с молекулярной массой 200 и 95% веществ с более низкой молекулярной массой (в том числе бактерии, молекулы пирогенов). Суть обратного осмоса: под давлением, превышающим осмотическое, высокоминерализованная вода диффундирует через полупроницаемую мембрану в отсек чистой воды.

К сожалению, невозможно контролировать наличие микроскопических механических дефектов в мембранах (уже имеющихся или возникающих под давлением фильтруемой воды), что ведет к попаданию микроорганизмов в чистую воду.

Дистилляция

Самый дорогой, но и самый эффективный метод получения воды любого назначения: как очищенной, так и дистиллированной. Этапы получения дистиллированной воды:

— нагрев исходной воды (после ее предварительной обработки, если в этом есть необходимость) до кипения и парообразования;

— поступление пара в конденсатор и конденсация;

— поступление конденсата в водоприемник: хранение и использование путем подачи через систему трубопроводов или иных механизмов доставки на рабочие места.

Теоретически дистиллят, полученный с соблюдением всех технологических правил перегонки воды, не должен содержать химические примеси в количествах выше допустимых пределов, должен быть стерильным и апирогенным. На практике это не всегда получается. Причины:

— неправильная регуляция скорости кипения и, как следствие, заброс капель исходной воды с паром в конденсатор;

— санитарное состояние дистиллятора, водоводов, водоприемников: нарушение режима их стерилизации способствует проникновению, сохранению и колонизации микроорганизмов (особенно грамотрицательных бактерий и плесневых грибов) на внутренних поверхностях аппаратуры и труб (ГФ XI, Приказ №309)

Для предотвращения возможности размножения микроорганизмов в получаемой дистиллированной воде рекомендовано хранить ее в одном из двух температурных режимов:

+5 — +10 °С (холодовой режим),

+80 — +95 °С (тепловой режим)

При обоих режимах вода должна находиться в постоянном движении со скоростью 1—3 м/сек (для предупреждения колонизации микробов на стенках).

Наиболее предпочтителен тепловой режим, так как при нем прекращается размножение микроорганизмов.

Вода очищенная, используемая для приготовления растворов, не подлежащих стерилизации в конечной упаковке, должна быть стерильной. Это растворы следующего назначения: глазные капли; офтальмологические растворы для орошения операционного поля в микрохирургии глаза; растворы для внутреннего и наружного применения для новорожденных и т. д. Если данные растворы стерилизуются в конечной упаковке, то воду предварительно не стерилизуют.

Нормативы санитарно-микробиологического состояния воды очищенной регламентируются ФС 42-2619-97: ОМЧ 100 микроорганизмов суммарно (бактерии и грибы) в 1 мл, отсутствие энтеробактерий, синегнойной палочки и золотистого стафилококка; срок хранения не более 3 суток; апирогенность.

Санитарно-эпидемиологическая служба при контроле санитарного режима аптек пользуется в настоящее время Приказом №3182-84 от 29 декабря 1984 г., согласно которому к дистиллированной воде, используемой для приготовления лекарственных средств (кроме инъекционных растворов и глазных капель), предъявляются те же требования, что и к питьевой воде (ГОСТ 2874-82): ОМЧ — до 100 сапрофитов в 1 мл, коли-титр — не менее 500 мл.

Вода для инъекций используется для приготовления инъекционных и инфузионных растворов, которые вводятся парентерально (минуя защитные кожно-слизистые барьеры, барьеры лимфатических образований). Поэтому к ней предъявляются более высокие санитарно-микробиологические требования. Согласно ФС 42-2620- 97 вода для инъекций должна соответствовать требованиям, предъявляемым к воде очищенной, и быть апирогенной. Срок хранения не более 24 часов, в асептических условиях при температурном режиме 5-10 оС (холодовой) или 85-90 оС (тепловой).

Санитарно-эпидемиологическая служба, согласно вышеупомянутому приказу, к воде для инъекций предъявляет следующие требования: ОМЧ до стерилизации — не более 15 микроорганизмов суммарно (бактерии и грибы) в 1 мл, содержание кишечной палочки и протея не допускается.

Бактериальные пирогены

Бактериальные пирогены — продукты жизнедеятельности и распада бактерий, а также погибшие микробные клетки. По химической природе бактериальные пирогены — вещества типа полисахаридов и полипептидов с молекулярной массой 8000 000, частицы которых достигают размеров от 50 нм до 1 мкм. Пирогенными свойствами обладают практически все бактерии: патогенные и сапрофитные, грамотрицательные и грамположительные, пигментные и непигментные. Но пирогенность грамотрицательных бактерий в 100 раз выше за счет липидных компонентов клеточной стенки (ЛПС и ЛПП). Например, пирогенность извлечений из Вас. subtillis для кролика проявляется при введении дозы 0, 08 мкг/кг и выше; ЛПС из возбудителей брюшного тифа (S. typhi) вызывает пирогенную реакцию у кролика в дозе 0, 06 мкг/кг, а из протея (Pr. vulgaris) — в дозе 0, 012 мкг/кг. У грамположительных бактерий пирогенность обусловлена мощным слоем пептидогликана.

Практически нет ни одного органа или ткани, системы, в которых не отмечалось бы функциональных сдвигов после введения в организм бактериальных пирогенов. Наиболее резкие пирогенные реакции возникают при внутрисосудистых, спинномозговых и черепно-мозговых инъекциях.

Клиника пирогенной реакции проявляется в следующих симптомах: озноб, повышение температуры; нарушение деятельности сердечно-сосудистой системы, падение артериального давления, рвота, диарея, развитие коматозного состояния и т. д.

Свойства пирогенов;

— свободно проходят через фарфоровые фильтры;

— адсорбируются на асбесте при фильтрации через фильтры Зейтца;

— теряют свою активность при длительном хранении (6-8 месяцев);

— сухой препарат Пирогены сохраняет свою активность до 5 лет;

— адсорбируются из раствора на стенках стеклянных емкостей, в которых хранятся жидкости.

Пирогенные вещества нелетучи и не перегоняются с водными парами при дистилляции воды. Загрязнение ими дистиллята может происходит за счет перебрасывания мельчайших капелек воды или переноса их сильной струей пара в холодильник.

Пирогены могут быть внесены в исходный раствор с водой или лекарственным веществом, но в основном они высвобождаются в процессе изготовления и термической стерилизации растворов, так как при этом происходит гибель и разрушение микроорганизмов, изначально находящихся в растворе. Есть определенная зависимость между количеством микробов в 1 мл до стерилизации и пирогенностью простерилизованной воды. Эта цифра колеблется в пределах 10³-10⁴ микробных клеток в 1 мл.

Методы разрушения пирогенов и предотвращения пирогенности:

— температурное воздействие, при котором разрушаются все органические вещества (пар под давлением — 5 часов, сухожаровой шкаф при t=180 оC — 4 часа, при t=200°C — 45 минут);

— фильтрация растворов для инфузий через асбестовые фильтры;

— интенсивное воздействие ультразвуком;

— сорбция активированным углем;

— обработка ферментами ();

— химический метод (использование горячего подкисленного 1% раствора перманганата калия для обработки стеклянных трубок дистилляторов, сосудов для сбора дистиллята с последующим отмыванием от раствора).

Освободить растворы от пирогенов технологически очень сложно и в условиях аптеки практически невозможно. Поэтому все усилия должны быть направлены на получение растворов, максимально свободных от сопутствующей микрофлоры.

С целью уменьшения риска образования пирогенов в результате размножения бактерий нормативными документами регламентированы сроки и условия хранения воды для инъекций до применения по назначению (ФС 42-2620-97), а также парентеральных растворов до стерилизации (не более 3 часов по Приказу № 309).

Исследование на пирогенность

Микробиологический метод (Дополнение № 5191-90 от 11 сентября 1990 г. к методическим указаниям «Микробиологический контроль в аптеках» от 29 декабря 1984 г.). Методика обнаружения пирогенобразующих микроорганизмов в дистиллированной воде, 0, 9% растворе хлорида натрия и 5, 10, 25 или 40%-м растворе глюкозы до стерилизации (не позднее 1, 5 часа после изготовления) основана на выявлении количества колоний грамотрицательных микроорганизмов с помощью 3% водного раствора гидроксида калия.

Суть метода: 1 мл исследуемого образца, взятого непосредственно перед стерилизацией, засевают по 0, 5 мл на поверхность двух чашек с МПА и термостатируют в течение 5 суток при температуре 30-35 °С. После инкубации в термостате каждую выросшую колонию смешивают с реактивом. Если в течение 60 секунд происходит образование желеобразной массы, данная колония образована грамотрицательными микроорганизмами, следовательно, испытуемый раствор содержит пирогенобразующие микроорганизмы. Для дистиллированной воды предельно допустимое количество пирогенобразующих единиц в 1 мл — 5, общее количество микроорганизмов — 15-20; для растворов глюкозы и натрия хлорида пирогенобразующих единиц— 10, общее количество микроорганизмов — 50. Недостатки метода: -

— значительная неточность, так как определяются только живые микроорганизмы, тогда как пирогенностью обладают и «обломки» бактериальной клетки;

— нельзя определить количество пирогена в исследуемом препарате;

— данная методика применяется только для перечисленных Растворов и только до стерилизации, что делает невозможным исследование других парентеральных препаратов.

Биологический метод (ГФ XI, т. 2, с. 183). Испытание проводят на здоровых кроликах обоего пола массой 2-3, 5 кг, содержавшихся на полноценном рационе. Каждый кролик должен находиться в помещении с постоянной температурой в отдельной клетке, при уборке которых необходимо избегать возбуждения животных. Перед проведением испытаний кроликам ежедневно измеряют температуру и взвешивают. Животные не должны терять в весе и должны иметь температуру в пределах 38, 5-39, 5 оС, в противном случае они не используются в опыте. Накануне испытания кролики переводятся в отдельное помещение, изолированное от шума, проводится контрольное измерение температуры и взвешивание. В испытании одного препарата используются не менее трех кроликов. Испытуемый препарат отбирается в количестве 2 флаконов или ампул из каждой серии, готовится общий раствор для каждой серии и вводится в ушную вену животному. Растворители для препарата, иглы и шприцы должны быть апирогенными. После введения испытуемого вещества измеряют температуру 3 раза с промежутками в 1 ч. Суммарно повышение температуры у 3 кроликов должно быть меньше или равно 1, 4оС. Превышение на 2, 2 °С означает, что испытуемый препарат обладает пирогенностью. Биологический метод имеет ряд недостатков:

— необходимость содержания животных и ухода за ними;

— невозможность повторного использования кроликов для определения пирогенности в последующих объектах при выявлении пирогенной реакции (только спустя 3 суток, если предыдущий препарат не обладал пирогенностью);

— широкий диапазон биологическ функциональных колебаний ответной реакции кроликов на одну и ту же дозу пирогена;

— невозможность определения количества пирогена в исследуемом препарате;

— возможность несоответствия величины пирогенных доз для кролика и человека (описаны случаи апирогенности раствора для кролика и пирогенной реакции у человека).

Более объективными являются физико-химические методы: полярография, люминесцентный метод, но они не нашли широкого применения.

ЛАЛ-тест — более чувствительный метод, основанный на процессе физико-химического взаимодействия эндотоксинов с лизатом клеток (амебоцитов) крови мечехвостов Limulus polyphemus¹, в результате которого происходит образование геля различной плотности (ЛАЛ-реактив — Лизат Амебоцитов Лимули, ВФС 42-2960- 97). (¹ - Морское животное, относящееся к типу членистоногих.)

Определение содержания бактериальных эндотоксинов (ЛАЛ-тест). Для проведения ЛАЛ-теста необходимы ЛАЛ-реактив, рабочий стандартный образец (РСО) эндотоксина, оттитрованный фирмой-производителем по Американскому национальному стандарту эндотоксина RSE (ЕС-5), и «вода для ЛАЛ-теста», которая должна быть свободна от бактериальных эндотоксинов (содержание эндотоксинов < 0, 001 ЕД э/мл) и, как правило, входит в состав наборов для ЛАЛ-теста.

Посуда (пробирки, пипетки и др.), используемая для проведения ЛАЛ-теста, должна быть стерильна и свободна от бактериальных эндотоксинов (тщательно вымыта и обработана сухим жаром при 250 °С в течение 1 часа или при 180 оС в течение 3 часов).

Содержание эндотоксина выражается в единицах эндотоксина (ЕДэ).

Проведение ЛАЛ-теста и интерпретация результатов

Качественный тест. Содержание ампулы или флакона с испытуемым препаратом разводят водой для ЛАЛ-теста. Кратность разведения {К) определяют по формуле:

где А — максимально допустимое содержание эндотоксина в препарате, указанное в частной фармакопейной статье; к — чувствительность ЛАЛ-реактива, указанная фирмой-производителем на этикетке упаковки.

Определение проводят в двух параллельных пробах. Полученный раствор препарата по 0, 1 мл помещают в две стеклянные пробирки диаметром 10 мм и добавляют по 0, 1 мл ЛАЛ-реактива.

Одновременно ставят положительный и отрицательный контроль опыта. Для проведения положительного контроля в две пробирки помещают по 0, 1 мл ЛАЛ-реактива и по 0, 1 мл раствора РСО эндотоксина. Для проведения отрицательного контроля в две пробирки вносят по 0, 1 мл ЛАЛ-реактива и по 0, 1 мл воды для ЛАЛ-теста.

Все реакционные смеси аккуратно перемешивают и одновременно помещают на 60 мин в водяную баню или термостат с температурой 370±1°С. Следует избегать вибрации и ударов во время инкубации. По истечении указанного срока результаты регистрируют только как положительные или отрицательные. Положительная реакция характеризуется образованием плотного геля, который не разрушается при поворачивании пробирки на 180°. При отрицательной реакции такой гель не образуется.

Результаты испытания лекарственного препарата с помощью ЛАЛ-теста можно оценивать лишь в том случае, когда в обеих пробирках с отрицательным контролем реакция отрицательна, а в обеих с положительным контролем - положительна.

Препарат считают выдержавшим испытания, если реакция отрицательна в обеих параллельных пробах. Если реакция положительна хотя бы в одной из проб, испытание повторяют с помощью полуколичественного теста.

Полуколичественный тест. Испытуемый препарат проверяют в ряду последовательных двукратных разведений водой для ЛАЛ-теста. Условия проведения количественного теста такие же, как и для качественного теста. Определение проводят в двух повторностях. Отрицательный и положительный контроли ставятся для всех серий разведений. Все пробирки инкубируются одновременно.

Для расчета количества эндотоксина в испытуемом препарате отмечается наиболее высокое разведение, дающее плотный гель, хотя бы в одной повторности. Содержание бактериальных эндотоксинов (С) определяется по формуле:

С = ТХ,

где: Т — титр наиболее высокого разведения препарата, дающего плотный гель,

X — чувствительность ЛАЛ-реактива, указанная фирмой-производителем на этикетке упаковки.

Препарат считают выдержавшим испытание, если полученное при определении количественное содержание эндотоксинов в нем не превышает максимально допустимую величину, указанную в частной фармакопейной статье.

Недостатком описанного метода является то, что с его помощью определяются только липополисахариды клеточной стенки микроорганизмов, в то время как пирогенностью обладают не только они.

В настоящее время данный тест рекомендуется использовать для выявления пирогенности практически всех парентеральных лекарственных препаратов.

Санитарно-микробиологический контроль воды,