Самостійна аудиторна робота. Дайте відповідь на поставлені запитання

Дайте відповідь на поставлені запитання

1 Як залежність швидкість ферментативних реакцій від:

а) концентрації ферменту,

б) концентрації субстрату,

в) температури,

г) рН середовища.

2.Виконати лабораторну роботу „Визначення активності аспартатамінотрансферази” і захистити протокол.

Принцип методу. В результаті переамінування під дією аспартатамінотрансферази (АсАТ) аспарагінова кислота перетворюється в щавелевооцтову (ЩОК). ЩОК здатна в процесі ферментативної реакції перетворюватися в піровиноградну кислоту (ПВК). При додаванні кислого 2, 4-динітрофенілгідразину (2, 4-ДФГ) ферментативний процес зупиняється і утворюється динітрофенілгідразин піровиноградної кислоти, який в лужному середовищі дає коричнево-червоне забарвлення, інтенсивність якого пропорційна кількості утвореної ПВК. Таким чином, по кількості утвореної ПВК можна судити про активність ферменту. Активність амінотрансфераз виражають в мікромолях ПВК, утвореної 1 мл сироватки крові за 1 годину інкубації при температурі 37^оС. В нормі активність АсАТ сироватки крові становить 0, 1-0, 45 мкмоль/год х мл.

Хід роботи.

В дві пробірки (дослідну і контрольну) вносять по 0, 5 мл субстратної суміші для визначення АсАТ і ставлять в термостат при 37^оС на 5 хвилин. Потім в дослідну пробірку додають 0, 1 мл сироватки крові, а в контрольну - 0, 1 мл води і 0, 5 мл р-ну 2, 4-ДФГ. Ставлять обидві пробірки в термостат на 60 хвилин при температурі 37^оС. Виймають пробірки, додають в дослідну пробу 0, 5 мл розчину 2, 4-ДФГ і залишають при кімнатній температурі на 20 хвилин. Далі додають по 5 мл 0, 4 н розчину NаОН в кожну пробірку, ретельно перемішують і залишають при кімнатній температурі на 10 хв для розвитку забарвлення. Оптичну густину вимірюють на ФЕКу в кюветі на 10 мм при зеленому світлофільтрі (500-560 нм) проти контролю.

Розрахунок активності ферменту виконують по приготовленому заздалегідь калібрувальному графіку (за допомогою стандартного розчину ПВК). Активність виражають в умовних одиницях з розрахунку на 1 мл сироватки. 1 одиниця АсАТ відповідає такій активності ферменту, яка здатна за даних умов утворювати 1 мкг ПВК. При обчисленні ферменту необхідно врахувати і розведення сироватки:

Х = А х 10, де

Х – одиниця активності ферменту;

10 - перерахунок на 1 мл;

А - кількість ПВК в 0, 1 мл сироватки, знайдена по калібрувальному графіку, мкг.

У сироватці крові здорових людей активність АсАТ, визначена при допомозі даного методу, коливається від 8 до 40 од. Перерахунок активності ферменту в мікромолі ПВК, що утворилася при інкубації 1 мл сироватки протягом 1 години при 37^оС, проводять за формулою:

А х 10

АсАТ = ---------, де

А – кількість ПВК в 0, 1 мл сироватки, знайдена по калібрувальному графіку, мкг;

88 - маса 1 мкмоль ПВК, мкг;

10 - коефіцієнт перерахунку на 1 мл сироватки.