Изомеризация 3-фосфоглицерата в 2-фосфоглицерат

Данная реакция сопровождается внутримолекулярным переносом оставшейся фосфатной группы, и две молекулы 3-фосфоглицериновой кислоты превращаются в две молекулы 2-фосфоглицериновую кислоту (2-фосфоглицерат):

Реакция легкообратима, протекает в присутствии ионов Mg²⁺. Кофактором фермента является 2, 3-бифосфоглицериновая кислота, аналогично тому, как в фосфоглюкомутазной реакции роль кофактора выполняет глюкозо-1, 6-дифосфат.

Дегидратация 2-фосфоглицерата с образованием фосфоенолпирувата начинает третий этап гликолиза

Эта реакция катализируется енолазой, при этом 2-фосфоглицерат в результате отщепления молекулы воды переходит в фосфоенолпируват (ФЕП), а фосфатная связь в положении 2 становится высокоэргической.