Главная страница Случайная страница
КАТЕГОРИИ:
АвтомобилиАстрономияБиологияГеографияДом и садДругие языкиДругоеИнформатикаИсторияКультураЛитератураЛогикаМатематикаМедицинаМеталлургияМеханикаОбразованиеОхрана трудаПедагогикаПолитикаПравоПсихологияРелигияРиторикаСоциологияСпортСтроительствоТехнологияТуризмФизикаФилософияФинансыХимияЧерчениеЭкологияЭкономикаЭлектроника
Фотометрические методы биохимического анализа
|
|
Измерение по калибровочной кривой. Правила построения калибровочного графика. Для построения калибровочных графиков используют несколько известных концентраций определяемого вещества. Обычно используют четыре-пять различных концентраций (калибровочных точек) стандартного раствора измеряемого вещества. Для каждой концентрации согласно методике определяют оптическую плотность (D). На оси абсцисс откладывается концентрация С, а на оси ординат – плотность D. Наносят точки на систему координат и через скопление точек наилучшим образом проводят линию – калибровочный график. Если законБугера-Ламберта-Бера соблюдается, то график будет иметь вид прямой линии, проходящей через нулевую точку (рис. 1).
D (E)
C1 C2 C3 C4 C5 Концентрация (С)
Рис. 1. Вид калибровочного графика при линейной зависимости оптической плотности от концентрации исследуемого вещества.
Концентрацию исследуемого вещества в опытной пробе находят прямо по графику, или по формуле: Сопыта = Dопыта · F, где F - это калибровочный коэффициент (фактор): F = Ccтандарта / Dcтандарта
Расчеты по калибровочным графикам обычно используют для методов, для которых имеются стабильные результаты изо дня в день (гемоглобин, общий белок).
Обучающая задача для самостоятельного решения. При определении общего белка в лаборатории пользуются калибровочным графиком. Для построения калибровочного графика из основного стандартного раствора белка (100 г/л) готовят ряд рабочих стандартных растворов, как указано в таблице 1. Из каждого разведения берут по 0, 1 мл рабочего раствора и вносят в пробирки, содержащие 5, 0 мл биуретового реактива. Через 30-60 мин замеряют экстинцию (Е) стандартных проб против биуретового реактива при длине волны 540-560 нм. Задание: 1. Построить калибровочный график на миллиметровой бумаге; 2) рассчитать концентрацию общего белка в исследуемой сыворотке крови, если получена экстинция Еоп= 0, 48; 3) Вычислить фактор пересчета F и использовать его для расчета концентрации белка в исследуемой пробе: 4) сравнить полученный результат с нормой и сделать вывод (норма для общего белка в сыворотке крови у взрослых – 65-85 г/л).
Таблица. Данные для построения калибровочного графика для определения общего белка сыворотки крови.
| № пробирок | Концентрация белка в стандартном растворе, г/л (С) | Экстинция Естандарта |
| 1. | 40, 0 | 0, 26 |
| 2. | 50, 0 | 0, 33 |
| 3. | 60, 0 | 0, 40 |
| 4. | 70, 0 | 0, 45 |
| 5. | 80, 0 | 0, 51 |
| 6. | 90, 0 | 0, 58 |
| 7. | 100, 0 | 0, 65 |
Решение:
1. На миллиметровой бумаге строят калибровочный график. Вычерчивается система координат из двух взаимно перпендикулярных осей: абсцисс х и ординат у. На оси абсцисс (горизонтальной) откладывают значения концентрации вещества, а на оси ординат (вертикальной) – значения экстинций. Масштаб выбирают так, чтобы калибровочный график в системе координат располагался под углом в 45о либо близко к этому значению. Такое расположение калибровочной кривой считается оптимальным. Для этого значения концентраций и соответствующих им экстинций откладываются в одних и тех же удобно выбранных отрезках длины в сантиметрах. Например, максимальная концентрация общего белка, равная 100 г/л, откладывается в 10 см, а соответствующая ей экстинция, соответствующая 0, 65, также откладывается в 10 см. Исходя из этого, рассчитывается масштаб в сантиметрах для каждой рабочей концентрации белка и каждой полученной экстинции. К каждой из осей координат в отмеченных точках проводят перпендикуляр. В месте пересечения двух перпендикуляров взаимосвязанной пары (концентрация - экстинция) ставится карандашом точка. Если серия калибровочных (стандартных) растворов состояла из 7 рабочих растворов, то и таких точек, соответственно, получается 7. Затем все полученные точки соединяются прямой линией, выходящей из нуля координат. Если точки не располагаются строго на прямой линии, то линия проводится в среднем положении между несколькими точками, незначительно отклоняющимися от прямой.
Е
0, 7
Еопыта
 |
Сопыта 100 белок, г/л
2. Для расчета концентрации общего белка в исследуемом образце сыворотки крови находим на оси ординат значение Еоп=0, 48 и опускаем перпендикуляр на ось абсцисс, точка пересечения будет соответствовать концентрации общего белка в исследуемом образце - 73, 3 г/л.
3. Для удобства в работе на основе калибровочного графика рассчитывают фактор (калибровочный коэффициент) пересчета F. Его вычисляют делением каждой концентрации рабочего стандарта на соответствующую ей экстинцию: F = Ccт /Eст. Таких факторов получается столько, сколько было концентраций рабочего стандарта. Вычисляют средний арифметический фактор Fср. Затем с его помощью составляется калибровочная таблица, где против каждого возможного значения экстинции опытных проб указывается соответствующая ей концентрация исследуемого компонента, рассчитанная по формуле: Соп = Еоп · Fср. В нашей задаче Fср = 153, 6, следовательно,
Соп = 0, 48 · 153, 6 = 73, 3 г/л.
4. Вывод концентрация общего белка в сыворотке крови составляет 73, 3 г/л, что соответствует норме.