ЗАНЯТИЕ 10. Исследование микрофлоры кормов.

Цель занятия. Ознакомиться с правилами взятия проб силоса для исследования. Определить микрофлору силоса № 1 и № 2: приготовление и микроскопия мазков; ознакомление с микробио­логическим исследованием силоса (посевы и учет основных физио­логических групп микроорганизмов на разных средах). Оценить качество силоса № 1 и 2 по А. Н. Михину.

Оборудование и материалы. Фарфоровые ступки с пестика­ми (стерильные). Предметные стекла. Краситель эритрозин. Горелки. Микроскопы. Кедровое масло. Силос № 1 и 2 в чашках. Вытяжки из силосов. Универсальный индикатор, пипетки. Фарфо­ровые чашки для определения рН. Стандарт (цветная шкала для определения рН). Весы и разновесы к ним. Чашки для взвешивания силоса. Пинцеты. Две банки с притертыми пробками. Банка с разведением силоса 1: 10 (40 г силоса-360 мл стерильной воды). Шесть колб со сте­рильной водой по 90 мл в каждой. Пипетки для приготовления разведений (на 10 мл). Штатив с питательными средами: МПА - 5 пробирок, СА - 4, САМ (сусло-агар с мелом) - 6, молоко - 6, сусло пивное - 6, лактоза - 5, картофельная среда Рушмана -5 пробирок.

Микрофлора кормов во многом обусловлена температурой, влажностью среды и видовым составом растений. Она меняется во время заготовки и последующего хранения кормов. После скашивания нарушаются защитные функции растения, микробы проникают внутрь, используют питательные вещества и разру­шают ткани. В это время особенно бурно развивается гнилостная микрофлора, вызывая порчу кормов. Скошенные растения можно сохранить путем высушивания или силосования, когда недоста­точно свободной воды или создаются такие условия, при которых прекращается деятельность аммонификаторов. Наряду с заго­товкой сена и сенажа в кормопроизводстве многих хозяйств одно из первых мест занимает силосование.

В кормах могут быть обнаружены плесневые грибы, гни­лостные, масляно-кислые и другие микроорганизмы. Такие корма часто вызывают отравления, расстройство органов пищеварения и других систем. В результате исследования можно выявить причину порчи корма, устранить ее и тем самым предупредить заболевание животных.

Определение микрофлоры силоса. Взятие проб силоса. Пробы силоса необходимо брать в три срока: а) во время заклад­ки силоса для определения эпифитной микро­флоры; б) через 10—15 дней после закладки для определения микрофлоры созревшего силоса; в) при вскрытии силоса.

В общей массе силоса не во всех ее участках одинаково проходят микробиологические процессы, поэтому в башне берут три пробы силоса: первую и вторую — на расстоянии одного метра от верха и низа, третью — между ними. В траншеях, в зависи­мости от длины, берут две или три пробы на глубине одного метра от поверхности. В круглых ямах пробу берут в центре после снятия верхнего слоя, также на глубине одного метра. Пробы силоса помещают в стерильные банки с притертыми проб­ками.

Микроскопическое исследование силоса. В фар­форовой ступке (с небольшим количеством стерильной дистил­лированной воды) растирают кусочек силоса. Из растертой массы на предметном стекле пестиком делают мазок, затем его фикси­руют и окрашивают эритрозином. Мазок рассматривают под иммерсионной системой и зарисовывают. В хорошем силосе встречаются единичные палочки и кокки, в плохом силосе обнаруживается большое число кокков и палочек.

Микробиологическое исследование силоса проводят для выявления разных физиологических групп микро­организмов; молочнокислых, масляно-кислых, гнилостных, газообразующих, дрожжей и плесеней.Перед посевом готовят разведения. С этой целью на технических весах отвешивают 40 г силосной массы. Навеску с соблюдением правил стерильности переносят в стерильную банку с притертой пробкой, в которую налито 360 мл стерильной воды. Чтобы «отмыть» микроорганизмы, содержащиеся на поверхности растений, силос в банке взбалтывают в течении 10 мин на шуттель-аппарате или руками. В банке получается разведение 1: 10. К этому времени должны быть готовы колбы со стерильной водой по 90 мл в каждой и сделаны надписи: II, III, IV, V, VI, VII. Последующие разведения готовят путем внесения 10 мл разведе­ния 1: 10 во вторую колбу с 90 мл стерильной воды, в результате чего получается разведение 1: 100. Из второй колбы 10 мл раз­ведения 1: 100 переносят в третью колбу, получается разведение 1: 1000 и т.д. Содержимое колбы перед взятием разведения силоса взбалтывают в течение 3 мин. После приготовления разведении готовят посуду (чашки Петри, пробирки), делают надписи.

Физиологические группы микроорганизмов определяют на следующих питательных средах:

МПА - гнилостную микрофлору.

СА - плесени и дрожжи.

САМ (с мелом) - молочнокислые бактерии,

молоке - молочнокислые бактерии,

лактозе - газообразующие (кишечные) бактерии,

картофельной среде Рушмана - масляно-кислые бациллы.

В приготовленную посуду и среды, начиная с последней колбы, вносят по 1 мл разведении: на МПА с I, II, III, IV, V разведениями; на СА с I, II, III, IV; на САМ со II, III, IV, V, VI, VII; на молоко с II, III, IV, V, VI, VII; на сусло пивное с II, III, IV, V, VI, VII; на лактозу с I, II, III, IV, V; на картофельную среду Рушмана с I, II, III, IV, V разведениями.

После охлаждения питательных сред до 50—45⁰С (а САМ и после тщательного взбалтывания) их вносят в чашки. Лег­кими вращательными движениями чашек смешивают разведе­ния силоса со средой и оставляют на ровной поверхности для застывания. Чашки, перевернутые вверх дном, выдерживают в термостате при температуре 30—35°С в течение трех суток. На четвертые сутки проводят учет физиологических групп микро­организмов. Численность разных физиологических групп микро­организмов на плотных питательных средах определяют путем подсчета колоний, на жидких питательных средах — путем обнаружения роста микробов из разных разведении, а на моло­ке — по свертыванию его. Та из свернувшихся сред, в которую было внесено наибольшее разведение, и будет определять коли­чество молочнокислых микроорганизмов в силосе. На плотных средах в чашках Петри подсчет ведут из трех разведении, в каждом из которых выросло не менее десяти колоний.

Оценка качества силоса. Органолептическая оценка силоса. Цвет должен быть ближе к цвету растений, из которых приготовлен силос. У доброкачественного силоса могут встречаться оттенки: желтый, желто-зеленый, коричнево-зеленый, светло-коричневый. У испорченного силоса преобладает коричневый цвет; обычно он бывает темно-коричневый, грязный. Запах доброкачественного силоса должен быть приятным, напоминающим запах плодов, хлебного кваса, моченых яблок. При порче силоса появляется запах уксуса. Испорченный силос имеет запах редьки, прогорклого масла, селедки, долго не исчезаю­щий при растирании кусочка силоса между пальцами. При наличии в силосе масляной кислоты растертый между пальцами силос издает неприятный запах навоза. Вкус доброкачественного силоса слабокислый, приятный. У испорченного силоса вкус резко кислый с горьковатым прив­кусом. Консистенция у доброкачественного силоса должна быть такой, какую имели исходные растения. У испорченного силоса расти­тельная масса делается ослизлой, мажущейся, листочки не от­деляются друг от друга.

Химическая оценка силоса. Приготовление вытяжки из силоса. В литровую банку (колбу) помещают 100 г мелко нарезанного силоса. В банку приблизительно до 3/4 объема нали­вают дистиллированную воду, тщательно взбалтывают и доливают до литра. Содержимое в течение 4—5 ч периодически взбалты­вают. Затем отфильтровывают и фильтрат используют для разных целей (например, для определения рН).

Определение рН силоса. Для определения рН силоса готовят две вытяжки: одну из хорошего силоса, другую — из заведомо недоброкачественного. Пипеткой в фарфоровую чашечку или углубление вносят 1 мл вытяжки и каплю универсального индика­тора. При смешивании жидкостей происходит изменение окраски вытяжки. Реакцию (рН силоса) определяют по стандартной шкале, которая нанесена на бумаге с защитным покрытием. По А. Н. Михину, в качестве индикатора используют смесь бромтимолового синего и метилового красного. В углубление фарфоровой чашки вносят 2 мл вытяжки и 2—3 капли смеси индикаторов. В зависимости от величины рН вытяжка приобретает разную окраску, которую находят по таблице.

Оценка качества силоса в баллах (по А. Н. Михину)

Данные балльной оценки при определении рН, запаха, цвета суммируют, получают общий балл, по которому и определяют качество силоса, баллов:

очень хороший 11-12

хороший 9-10

среднего качества 7-8

плохой 4-6

На практике рН силоса определяют также колориметрическим, электрометрическим и другими методами.

Силос, имеющий оценку 3 балла и ниже, считается очень плохим и к скармливанию животным непригоден.

Исследование силоса на присутствие в нем токсина ботулинуса. Силос часто загрязняется почвой, в которой наряду с другими микроорганизмами могут быть бациллы ботулинуса (Cl. botulinum). Такие микробы в силосуемой массе распределяются нерав­номерно, гнездно, то есть там, где имеется почва. Из подозри­тельных участков берут 1—2 кг силоса и помещают его в стерильные широкогорлые колбы. Пробы заливают двойным количеством стерильной воды и оставляют для экстрагирования. Затем часть воды и корма переносят в стерильную фарфоровую ступку и растирают. Выдерживают 1—2 ч и после этого фильтруют до получения прозрачной жидкости.

Наличие токсина ботулинуса в силосе определяют на морских свинках или белых мышах. Фильтрат делят на две части: одну из них нагревают до 80-100°С для разрушения токсина, другую оставляют без изменения. Опыт ставят на четырех свинках. Материал выпаивают при помощи шприца с конюлей или шприца без иглы. Двум животным дают по 2 мл прогретого фильтрата, остальным — такое же количество фильтрата, но не подвергавшегося термической обработке.

При содержании в непрогретом фильтрате токсина у животных появляются параличи задних конечностей, брюшных мышц и другие признаки, характерные для отравления. Морские свинки обычно в течение 2—3 сут погибают. Это дает основание (при отсутствии клиники болезни у контрольных животных, которым выпаивали прогретый фильтрат) считать, что в исследуемом материале имеется токсин.

Определение наличия токсина в силосе можно проводить и на белых мышах, при этом дозу фильтрата уменьшают до 0, 5_1 мл. Отсутствие характерной клиники болезни не исключает наличие токсина ботулинуса в корме, поэтому исследование повторяют.