После разрезания ферментом EcoRI

Таким образом, рестриктазы (рестрикционные нуклеазы) – это ферменты, способные узнавать специфические последовательности (4-6 нуклеотидов) ДНК и разрезать их в строго определенных местах. Когда два разных образца обрабатывают одной и той же рестриктазой, а затем смешивают эти образцы, то благодаря комплементарному спариванию фрагментов разных образцов могут образовываться новые комбинации генов – рекомбинантные ДНК.

2. ДНК-лигазы осуществляют «сшивание» (связывание) фрагментов ДНК, образуемых в процессе репликации за счет образования фосфодиэфирных связей между соседними нуклеотидами. Бактериальная ДНК-лигаза склеивает разрывы за счет «липких концов». Лигаза фага Т4 соединяет двунитевые фрагменты ДНК, содержащие ровные концы. Лигазы являются второй по важности в генетической инженерии группой ферментов.

Ниже представлен процесс сшивания фрагментов ДНК, содержащих нужные гены, с использованием двух основных методов:

1. По «липким» концам;

2. С помощью искусственно достроенных «липких» концов.

Сшивание генов (фрагментов) ДНК по «липким» концам комплементарных участков, длиной от 4 до 6 пар нуклеотидов, достаточно легко осуществляется ферментом ДНК-лигазой с образованием ковалентной связи между соседними нуклеотидами:

– – А Т Г Ц А А Т Т Ц А Г Т Ц – – – – – –

Т А Ц Г Т Т А А Г Т Ц А Г – – – – – –

Сшивание ДНК - лигаза

А Т Г Ц А А Т Т – Ц А Г Т Ц

Т А Ц Г– Т Т А А – Г Т Ц А Г

При отсутствии таких «липких» концов у сшиваемых фрагментов их достраивают, т. е. синтезируют искусственно ферментативным путём. Для этой цели применяют линкеры (или «переходники») – короткие участки ДНК, имеющие разные «липкие» концы:

– А Т Г Ц А А Т Т Ц Т Г А Г А Т Ц Ц А Т А Ц Г

– Т А Ц Г Т Т А А Г А Ц Т Ц Т А Г Г Т А Т Г Ц

Фрагмент 1 Линкер Фрагмент 2

Переходниковые линкерные фрагменты обеспечивают как объединение генов, так их экспрессию, для чего в середину линкера помещают какой-либо регуляторный генетический элемент, например промотор, или участок связывания с рибосомой.

Возможно сшивание фрагментов и по тупым концам, когда концы фрагментов двунитевые:

– – – А Т Г Ц Г Г Г Ц Ц Ц Г Т А – – – – – –

– – – Т А Ц Г Ц Ц Ц Г Г Г Ц А Т – – – – – –

В данном случае реакция лигирования (сшивания) имеет биохимические особенности и её эффективность ниже, чем при сшивании по «липким» концам.

Сшитая рекомбинантная ДНК вводится в живые клетки. Однако она не способна к самовоспроизведению, в связи с чем, её разрушают внутриклеточные нуклеазы. Для того чтобы рекомбинантная ДНК стала составной частью генетического аппарата клетки она должна:

1. Встроиться (интегрироваться) в геном клетки и реплицироваться, либо быть способной к автономной репликации молекулы ДНК;

2. Иметь способность автономно реплицироваться посредством векторных молекул). К их числу относят плазмиды, бактериофаги, вирусы животных.

Используя ферменты рестриктаз и лигаз, на сегодняшний день решена проблема конструирования разнообразных по своим составным частям гибридных (рекомбинантных) ДНК, путём сшивания фрагментов разных видов in vitro. Основное назначение полученных гибридных генов попавших в клетку заключается в том, чтобы производить новые белки.

Рестрикционные карты.

На основании изучения фрагментов ДНК создают «Рестрикционные карты». На этих картах представлена последовательность всех нуклеотидов, входящих в состав ДНК, а также отмечены сайты (места) действия рестриктаз. Первая такая карта была получена для вируса SW40 (обезьяний вирус, вызывающий злокачественную трансформацию), содержащего 5423 пары оснований (рис. 8. 7).

Помимо рестриктаз и ДНК-лигаз в генно-инженерных работах используются и другие ферменты:

3. Ревертаза. Ее функция связана с синтезом на матрице м-РНК.

Рис. 8. 7. Первая рестрикционная карта получена для вируса SW40 (обезьяний вирус), содержащего 5423 пары оснований

4. ДНК и РНК-полимеразы обладают общим свойством вести матричный синтез нуклеиновых кислот в направлении 5¹ → 3¹.

5. Терминальная трансфераза – способна наращивать на концах фрагментов ДНК однонитевые участки путем последовательного присоединения нуклеотидных остатков. Ее используют для создания на соединяемых фрагментах ДНК искусственных липких концов.

6. Нуклеазы – это большой класс ферментов, расщепляющих молекулы нуклеиновых кислот. Имеются нуклеазы, расщепляющие одно - или двуцепочные ДНК или РНК путем отщепления по одному нуклеотиду или небольших олигонуклеотидов.

8. 4. Технология получения рекомбинантной молекулы ДНК

Основные элементы технологии:

1. Для внедрения какого либо гена в клетку – реципиент (принимающую клетку) используют небольшую молекулу ДНК, которая обладает способностью проникать в эту клетку (рис. 8.8). Такую молекулу называют вектором.

1 2

3 4 5 6 7

Рис. 8.8. Элементы технологии получения