Для электрофореза ДНК в агаровом геле

Установлено, что если после электрофореза окрасить гель красителем этидиум бромидом, связывающимся с ДНК, и поместить гель под ультрафиолетовый свет, то на нём будут хорошо видны окрашенные в красный цвет, расположенные на различном расстоянии друг от друга светящиеся фракции ДНК. Каждая такая фракция соответствует одному фрагменту ДНК. При этом разные рестриктазы дают разную картину расщепления одной и той же ДНК (электрофоторгамма на рис. 8. 12., справа).

В результате, электрофорез в агаровом геле позволяет разделить, а затем легко извлечь любые рестрикционные фрагменты ДНК в чистом виде, для последующего использования. Кроме этого, анализируя электрофорезные спектры ДНК на геле, наблюдая за исчезновением одних и появлением других фракций под действием разных рестриктаз, в практических условиях уже составляют генетические рестрикционные карты расположения участков ДНК. Первую полную физическую карту расположения участков 14 рестриктаз составил Д. Натанс для ДНК вируса sv- 40.

В 1975 году был разработан метод, который позволяет идентифицировать конкретные гены и другие рестрикционные фрагменты ДНК после их электрофорезного разделения. Метод включает следующие этапы: 1. Фрагменты ДНК, разделённые в агаровом геле, денатурируются до одноцепочных молекул; 2. Весь электрофорезный спектр ДНК отпечатывается за счёт капиллярных сил на приложенной к гелю нитроцеллюлозной мембранной плёнке. После этого фиксируется при помощи высокой температуры (рис. 8.13).

3. Мембрана помещается в гибридизационный буфер, содержащий специальный радиоактивно меченый ДНКовый зонд. Зонд способен гибридизоваться с определённым комплементарным фрагментом ДНК и свяжется только с одной или несколькими конкретными фракциями из всего электрофоретического спектра полученных рестрикционных фрагментов ДНК.

1 2

4

Рис. 8.13. Схематическое изображение основных этапов