Методи виявлення мікобактерій туберкульозу

Збудниками туберкульозу, мікобактеріозу і лепри є кислотостійкі мікобактерії (рід Mycobacterium). Цей рід включає більше 30 самостійних типів. Вони широко розповсюджені в природі (ґрунті, воді, харчових продуктах) та серед людей, тварин. Збудник туберкульозу може

існувати у різних фор­мах: паличок завдовжки від 0, 8 до 5 мікрон і завтовшки від 0, 2 до 0, 3 мікрон, осколків, L-форм (тобто структур, що втратили клітинну стінку внаслідок впливу несприятливих факторів (антибіоти­ків, дезинфікуючих речовин і т.п.)) і форм, що фільтруються.

Туберкульоз у людини викликають Mycobacterium tuberculosis (людський тип), Mycobacterium bovis (бичачий тип) та Mycobacterium africanum (проміжний вид). Це так звані

істинні мікобактерії туберкульозу (МБТ) – І група мікобактерій. Найбільш часто туберкульоз у людей виникає при зараженні людським видом збудника (90 – 85% випадків), МБТ бичачого виду виявляють у 5 – 10% хворих (переважно у жителів сільської місцевості при наявності хворих тварин). Проміжний вид мікобактерій є причиною туберкульозу не більш ніж в 3% випадків (у людей в країнах Африки).

ІІ група мікобактерій – це кислотостійкі сапрофіти, тобто мікобактерії, які є непатогенними для люди­ни і тварини.

Серед кислотостійких мікобактерій виділяють такі, які за культуральними та біохімічними властивостями відрізняються від МБТ. Це ІІІ група мікобактерій – не туберкульозні мікобактерії (НТБ МБ). Деякі з них умовно або потенційно патогенні для людини і в певних умовах (особливо в осіб з імунодефіцитами різного ґенезу, в тому числі і при ВІЛ-інфекції) можуть викликати захворювання легень та інших органів – мікобактеріози, які за морфологічними та клінічними ознаками подібні до туберкульозу. До НТБ МБ належать: Mycobacterium аviит, Mycobacterium іntrасеllularае, Mycobacterium scrofulасеит (скорочено МАІS) та ін­ші (М. ulcerans, М. таrіпит, М. капsasіі, М. fоrtuіtит, М. chelonei, М. хепору).

Нетуберкульозні мікобактерії за класифікацією E.H.Runyon поділені на чотири групи залежно від швидкості росту і пігментоутворення:

1) група – фотохромогенні НТБ МБ – утворюють лимонно-жовтий пігмент під час експозиції культури на світлі, колонії виростають протягом 2 – 3 тижнів. До цієї групи належать М. таrіпит, М. капsasіі.

2) група – скотохромогенні НТБ МБ і, які утворюють оранжево-жовтий пігмент у темряві. Поширені у воді, ґрунті. До цієї групи належать M. aquae, M. scrofulасеит.

3) група – нефотохромогенні НТБ МБ. Культури слабкопігментовані або непігментовані, видимий ріст виявляється вже через 5 - 10 діб. Різні за вірулентністю і оптимальною температурою росту. Трапляються в ґрунті, у воді, у різних тварин (свиней, овець). Представниками цієї групи є М. аvіит, М. іntrасеllularае, М. хепору.

4) IV група – НТБ МБ, що швидко ростуть на поживних середовищах. Ріст дають через 2 – 5 днів. Переважно це сапрофіти:

М. рhelei, М. smegmatis, М. fortuitum.

Mycobacterium leprae є етіологічним чинником лепри в людини. Цей тип мікобактерій не росте на живильних середовищах (in vitro), але можливий їх пасаж через мишей.

Для виявлення мікобактерій туберкульозу викори­стовують різноманітні біологічні та патологічні матеріали для мікробіологічних досліджень.

Важливу роль в мікробіологічній діагностиці туберкульозу легень має отримання мокротиння для досліджень. Мокротиння хворого – це суміш секрету залоз слизової оболонки трахеї і бронхів, серозного випоту з патологічно змінених судин, іноді частинок казеозних мас, некро­тичної грануляційної і легеневої тканини, а також домішки солей. Мокротиння виді­ляється при багатьох захворюваннях легень і бронхів.

Макроскопічно у хворих на туберкульоз легень мокротиння має слизовий або слизово-гнійний характер, без запаху, гомогенне, не утворює шарів. Кількість мокротиння може бути різною. На початку захворювання на туберкульоз легень мокротиння, як правило, не виділяється, потім воно може виділятись вранці окремими плювками, пізніше його кількість може досягати 100 - 200 мл.

Якщо медичний працівник не навчить хворого правильно відкашлюва­ти і збирати мокротиння, то ефективність бактеріологічного виділення МБТ знижу­ється. У туберкульозних закладах хворі збирають мокротиння в індивідуальні контейнери, на чверть ємності заповнені розчином хлораміну, де воно частково дезінфікується. Контейнери градуйовані, і це дає змогу визначати добову кількість мокротиння.

При отриманні мокротиння для бактеріологічних досліджень слід додержуватись таких правил:

– хворий повинен почистити зуби, ретельно прополоскати ротову порожнину,
сплюнути носоглотковий слиз і слину, відкашляти і зібрати тільки вміст дихальних шляхів;

– якщо у хворого мало мокротиння, можна з вечора призначити відхаркувальні засоби (бромгексин або амброксол, а в разі необхідності збирають мокротиння протягом доби, при умові, що воно буде зберігатись в холодильнику (без замерзання), а вранці разом з ранковою порцією буде доставлено в лабораторію;

– в разі, якщо мокротиння не відходить, то використовують провокуючі подразнювальні

інгаляції. Для цього в 1л стерильної дистильованої води розчиняють 150г повареної

(кухонної) солі і 20 - 30г харчової соди. Для провокації виділення мокротиння необхідно

30 – 60 мл розчину підігріти до температури 42 – 45°С і вдихати аерозоль протягом 10 – 15

хвилин за допомогою аерозольного інгалятора. У зв’язку з тим, що процедура спричиняє

гіперсалівацію, хворий має видалити слину в посуд з дезінфектантом, а після цього зібрати

мокротиння для дослідження;

– у дітей досліджують промивні води шлунку, взяті зондом натщесерце (так як діти частіше не відхаркують мокротиння, а ковтають його);

– ранкову порцію мокротиння необхідно доставляти в лабораторію в той же
день.

При необхідності в період транспортування мокротиння заливають подвійним об'ємом одного із консервантів (гліцерин, 2, 0% борна кислота, 10, 0% тринатрій фосфат).

Для того, щоб бути впевненим, що в лабораторію потрапило мокротиння, а не
слина, готують мазок-препарат і фарбують за Грамом згідно з загальноприйнятою
методикою. При мікроскопії мокротиння в полі зору повинно бути не більше 10 епітеліальних клітин і більше 20 лейкоцитарних клітин на 100 підрахованих, при цьому 80, 0 %всіх мікроорганізмів знаходяться в нейтрофілах і навколо них, переважають мікроорганізми одного морфологічного типу.

При підозрі на туберкульоз легень з метою діагностики обов’язково збирають 2 зразки мокротиння протягом двох днів послідовно: 1-й – на місці, коли пацієнт приходить до медичного закладу, 2-й – у медичному закладі, коли пацієнт приносить зібрану ним ранкову порцію мокротиння (з метою контролю за ефективністю хіміотерапії збирають 2 зразки мокротиння послідовно протягом 2-х днів). Кожну пробу мокротиння одразу реєструють, маркують та досліджують окремо (проби ні в якому разі не змішують). В туберкульозних установах в обов’язковому порядку досліджують 300 полів зору мазка-препарату, на відміну від закладів загальної медичної мережі, де досліджується лише 100 полів зору.

Кров для досліджень отримують капілярну або венозну за загальноприйнятими методиками, дотримуючись правил асептики та стерильності інструментів і посуду, який використовується.

Менструальну кров у жінок потрібно збирати не тампоном, а методом відсмоктування або за допомогою ковпачка Кафка. Перед початком досліджень отриманий матеріал (кров) можна звільнити від еритроцитів, для чого проводять відмивання еритроцитів дистильованою водою (стерильною) з послідуючим центрифугуванням, але при цьому зменшується вірогідність виділення збудника туберкульозу.

Патологічний матеріал отримують при оперативних втручаннях на нирках, статевих органах тощо, ендометричному відборі матеріалу, при біопсії слизової оболонки бронхів, трансбронхіальній біопсії внутрішньогрудних лімфатичних вузлів, трансбронхіальній біопсії легень, трансторакальній біопсії легень, торакоскопічній біопсії плеври.

Для встановлення етіологічного діагнозу при ураженні кісток і суглобів як матеріал на

мікроскопічне (бактеріоскопічне та цитологічне) дослідження беруть виділення з нориць, пункційний та біопсійний матеріал (відбиток) із суглоба і його синовіальної оболонки, гнійних специфічних абсцесів ураженої кістки та реґіонарних лімфатич­них вузлів. Пунктат отримують стерильним шприцом, вміст якого виливають в стерильний посуд і одразу направляють в лабораторію.

Для дослідження може бути отриманий матеріал при оперативному втручанні на кістках і суглобах, який складається з гнійно-некротичних мас, грануляцій, кіст­кової тканини та інших субстратів.

При бактеріологічному дослідженні синовіальної рідини необхідно безпосере­дньо перед пункцією провести її відбір в 3, 0% розчин цитрату натрію (співвідно­шення 1: 1) для попередження згортання.

Бактеріоскопічне дослідження будь-якого матеріалу здійсню­ють класичним методом, виявляючи мікобактерії у пофарбова­них за Цілем-Нільсеном препаратах.

У ході мікроскопічного дослідження нативних і пофарбова­них за Паппенгеймом препаратів із вищезазначеного біологіч­ного матеріалу можна встановити присутність епітеліоїдних клітин, гігантських багатоядерних клітин Пирогова-Лангханса, лімфоцитів, нейтрофілів, плазмоцитів,

інших елементів хронічного запалення. Усі ці елементи (специфічного і неспе­цифічного запалення) виявляють на фоні казеозного детриту.

У нативному препараті крім зазначених елементів можна виявити ще й еластичні волокна (прості, коралоподібні або звапнені), кристали холестерину.

При будь-яких цитограмах фарбування матеріалу за Цілем-Нільсеном необхідне та обов'язкове.

При туберкульозі лімфатичних вузлів патологічний матеріал (гній) отримують за допомогою пункції і Надалі роблять так, як при туберкульозі кісток.

При туберкульозі нирок основним матеріалом досліджень являється сеча. Ранню діагностику доклінічних форм можна провести лише за умов багаторазових (не менше 5 разів) бактеріоскопічних досліджень стерильно взятої сечі. При отриманні сечі попередньо зовнішні статеві органи обмивають водою з милом або слабким розчином калію перманганату. Особливо ретельно обробляють зовнішню частину уретри. В стерильний флакон збирають середню порцію ранкової сечі. Відбирання добової сечі для бактеріологічних досліджень не зовсім доцільно, так як в сечі можуть бути бактерицидні субстанції, які не лише пригнічують життєдіяльність МБТ, але протягом доби можуть їх знищувати. До того ж доведено, що при зберіганні сечі більше однієї години, кількість мікробних клітин неспецифічної мікрофлори збільшується в декілька разів.

Сечу з ниркових мисок збирають в стерильні пробірки при катетеризації кожної нирки окремо.

Для виявлення МБТ сечу багаторазово центрифугують, нашаровуючи кожен раз нові порції з осаду сечі на предметне скло. Мазок забарвлюють за методом Ціля-Нільсена. Виявлення міко-бактерій туберкульозу в сечі свідчить про наявність тубер­кульозу нирок.

Для дослідження сечі за методом флотації дають їй відстоятись, потім 20 - 30мл осаду обробляють, як звичайно, без підігрівання на водяній бані. Відсутність МБТ в гнійній сечі ще не

виключає наявності туберкульозу нирок.

У разі отримання нега­тивних результатів потрібно ставити біологічну пробу на морсь­ких свинках. Крім цих основних для встановлення діагнозу ме­тодів слід звертати увагу на наявність у хворого піурії, склопо­дібних і цвяхоподібних лейкоцитів в осаді сечі, постійну кислу реакцію сечі, а при деструктивних процесах у нирках – на на­явність елементів туберкульозної гранульоми в осаді. Цитологічному та бактеріологічному дослідженню можна піддавати пунктат або відбиток біоптату ураженої нирки.

При туберкульозі чоловічих статевих органів застосовують мікроско­пічне дослідження наступних видів біологічного матеріалу: сеча, еякулят, секрет передміхурової залози, пунктати та від­битки біопсійного матеріалу відповідних органів (у тому числі й регіонарних лімфатичних вузлів). За наявності нориць для дослідження можна використовувати гній (чи інший вміст), що з них виділяється.

При туберкульозі жіночих статевих органів мате­ріалом для дослідження є піхвові виділення, менструальна кров, зіскоб із шийки матки, з ендометрію та з виразок на зовнішніх статевих органах (якщо виразки покриті гноєм або є нориці, то на дослідження беруть гній або виділення з нориць). При ура­женні маткових труб та яєчників можна також досліджувати пунктати цих органів.

Іноді для діагностики туберкульозу жіночих статевих органів (до речі, й інших органів також) доводиться досліджувати пун­ктати регіонарних лімфатичних вузлів або матеріал з нориць лімфатичних вузлів.

Дослідження калу на МБТ слід проводити у випадках підозри на туберкульоз ки­шок. При цьому треба пам'ятати, що у хворих, які виділяють МБТ і частково заковту­ють мокротиння, МБТ можна виявити при дослідженні калу і за неуражених кишок, оскільки мікобактерії туберкульозу стійкі і не завжди гинуть під впливом травних соків. У калі хворих на туберкульоз кишок часто виявляється слиз, кров і домішки гною.

При туберкульозі органів ЦНС визначальний метод його лабораторної діагностики –

дослідження спинномозкової рідини: прозора, з деякою опалесценцією (за рахунок збільшення кількості грубодисперсних білків), цитоз підвищений ( 100 – 400 клітин в 1 мкл) з переважанням лімфоцитів (лімфоцитарний плеоцитоз); підвищений вміст білка (позитивні реакції Панді та Нонне-Апельта), хоча у деяких хворих може залишатися без змін; зниже­ний рівень глюкози та хлоридів. У разі відстоювання спинно­мозкової рідини за кімнатної температури (можна і в холодиль­нику) на її поверхні утворюється ніжна плівка з фібрину. Саме в цій плівці найімовірніше виявити мікобактерії тубер­кульозу, плівку наносять на предметне скло і готують препарат за методом Ціля-Нільсена. У випадках, коли плівка не утворюється, препа­рат готують з осаду після центрифугування.

Слід зауважити, що навіть за умови встановлення без­сумнівного діагнозу туберкульозного менінгіту мікобактерії у спинномозковій рідині виявляють лише у 10 – 20% хворих. При ура­женні туберкульозом (чи за підозри на цей процес) або для диференційної діагностики об'ємних процесів у головному та спин­ному мозку необхідно досліджувати операційний матеріал (відбитки, пунктати) у цитологічних препаратах, пофарбованих за Паппенгеймом, та у препаратах, пофарбованих за Цілем-Нільсеном.

При туберкульозі серозних оболонок з метою діаг­ностики використовують цитологічне та бактеріоскопічне дос­лідження рідини з відповідних порожнин (ексудат може бути серозним, серозно-гнійним, гнійним або геморагічним). В осаді ексудату клітинний склад різниться залежно від стадії захво­рювання. Рідко, однак все таки в ексудаті трапляються елементи туберкульоз­ної гранульоми. Іноді вдаються до пункційної біопсії серозної оболонки (ендоскопічний метод), а дослідження відбитків біоптату надають додаткову діагностичну інформацію.

Лабораторна діагностика туберкульозу позалегеневих форм інших локалізацій, що самостійно розвивається нечасто (тубер­кульоз лімфатичних вузлів, шкіри, слизових оболонок, ока, шлунка, кишок), здійснюється тими самими методами (цито­логічним та бактеріоскопічним) у відповідному матеріалі (гній із нориць, пунктати, відбитки біоптату, мазки-відбитки з уражених поверхонь, зіскоби тощо).