Метод количественного определения содержания белка в сыворотке крови по цветной реакции с биуретовым реактивом.

Принцип метода: Ионы меди в щелочной среде при взаимодействии с пептидными связями в структуре белка дают комплексное соединение сине-фиолетового цвета. Интенсивность окраски прямопропорциональна концентрации белка в растворе. Оптическую плотность окрашенного раствора определяют на ФЭКе при зеленом светофильтре в кюветах шириной 10 мм.

Ход работы: В две пробирки налить по 5 мл биуретового реактива. В первую (опытная) пробирку внести 0, 1 мл исследуемой сыворотки, во вторую (контрольная) – 0, 1 мл дистиллированной воды. Через 30 минут инкубации при комнатной температуре колориметрировать на ФЭКе. Концентрацию белка определить при помощи калибровочного графика. Сравнить с нормой. Сделать вывод. Для анализа должно быть подготовлено 3 пробы сыворотки крови (или имитация) – норма, гипопротеинемия и гиперпротеинемия.

Хроматографическое разделение смеси аминокислот(гидролизат белка). Теоретический анализ хроматограмм аминокислот (одна на пару студентов) Работа 2. Анализ хроматограмм гидролизатов различных белков.

ОБОРУДОВАНИЕ: хроматограммы различных белков, пробирки со спиртовым раствором для экстракции.

ПРИНЦИП МЕТОДА.

Аминокислотный состав гидролизатов белков исследуется с помощью распределительной хроматографии на бумаге. Распределительная хроматография основана на способности веществ по-разному адсорбироваться на адсорбентах и по-разному растворяться в полярных и неполярных растворителях. В качестве адсорбента в данном методе используется хроматографическая бумага. Разделение проводится смесью растворителей (бутанол + ледяная уксусная кислота + вода в соотношении 4: 1: 5). При этом вода удерживается бумагой, а органический растворитель движется по бумаге с определенной скоростью. Вещества (в данном случае аминокислоты), растворимые в органическом растворителе, будут двигаться по бумаге вместе с растворителем. Вещества, растворимые в воде, займут на хроматограмме промежуточное положение между линией старта и линией фронта растворителя. После окончания разделения и высушивания хроматограммы ее проявляют раствором нингидрина и вновь высушивают. После этого пятна разделенных аминокислот становятся видимыми и доступными для качественного и количественного анализа.

ХОД РАБОТЫ.

Студенты исследуют готовые хроматограммы различных белков.

1. Качественный анализ хроматограмм (идентификация пятен аминокислот). Производится путем расчета коэффициентов Rfдля каждого пятна:

где Rf - коэффициент распределения,

lв-ва - путь, пройденный веществом от линии старта,

lф.р. - путь, пройденный фронтом растворителя от линии старта.

Пользуясь табличными значениями Rfдля каждой аминокислоты, идентифицируют аминокислоты исследуемой хроматограммы. Для расчета коэффициента измеряют расстояния от линии старта до центра каждого пятна и расстояние от линии старта до линии фронта растворителя.

Рассчитанные значения коэффициентов Rfсравнивают с табличными данными и идентифицируют таким образом все пятна аминокислот на хроматограмме.

Задание на следующее занятие. Ферменты из РАБОЧЕЙ ТЕТРАДИ ПО БИОХИМИИ.

Вопросы по теме для самостоятельного изучения их студентами: структура и функциональная роль шаперонов.

Практические навыки, которыми должен овладеть студент по теме занятия:

- написание структур пептидов из протеиногенных аминокислот

- определение содержания белка в сыворотке крови, интерпретация полученного результата

- анализ готовых хроматограмм, интерпретация результата

Темы для реферативных сообщений – «Супервторичная и доменная структуры белка, их функциональное значение»