Билет №23

1.Приготовление препарата для изучения микроорганизмов в нативном виде.
Метод «висячей капли». Препарат готовят на покровном стекле, в центре которого наносят одну каплю бактериальной культуры. Затем предметное стекло с лункой, края которой предварительно смазывают вазелином, прижимают к покровному стеклу так, чтобы капля находилась в центре лунки. Быстрым движением переворачивают препарат покровным стеклом вверх. В правильно приготовленном препарате капля должна свободно висеть над лункой, не касаясь ее дна или края.
Для микроскопии вначале используют малый сухой объектив 8Х, под увеличением которого находят край капли, а затем устанавливают объектив 40Х и исследуют препарат.
Метод «раздавленной» капли. На поверхность обезжиренного предметного стекла наносят каплю исследуемого материала или суспензию бактерий и покрывают ее покровным стеклом. Капля должна быть небольшой, не выходящей за край покровного стекла. Микроскопируют препарат с объективом 40Х.
После микроскопии препараты «раздавленной» капли или «висячей» капли опускают в дезинфицирующий раствор.

2.Для культивирования анаэробных микроорганизмов необходимо создание бескислородных условий, достигаемое различными методами.Физические методы основаны на создании вакуума в специальных аппаратах — анаэростатах. Иногда воздух в них заменяют каким-либо другим газом, например СО2. Доступ кислорода в питательную среду можно затруднить, если культивировать анаэробов в глубине столбика сахарного агара или среды Вильсона — Блера, налитых в пробирки в расплавленном состоянии и остуженных до 43°С. По методу Вейона — Виньяля расплавленный и остуженный агар с посевным материалом набирают в стеклянные трубочки, которые запаивают с двух концов.

Химические методы заключаются в том, что при культивировании исследуемого материала на плотных средах в эксикатор помещают химические вещества, например пирогаллол и щелочь, реакция между которыми идет с поглощением кислорода. В жидкие питательные среды можно добавлять различные редуцирующие вещества: аскорбиновую или тиогликолевую кислоту.

Биологический метод основан на одновременном культивировании аэробов и анаэробов на плотных питательных средах в чашках Петри, герметически закупоренных. Вначале кислород поглощается растущими аэробами, посеянными на одной половине среды, а затем начинается рост анаэробов, посев которых сделан на другой половине. Наиболее удобна для культивирования анаэробов специальная среда Китта — Тароцци. В нее входят сахарный МПБ, который наливают в пробирки в количестве 10—12 мл, и кусочки вареных паренхиматозных органов. Перед употреблением среду Китта, — Тароцци кипятят на водяной бане для удаления растворенного в ней кислорода. Среду заливают сверху стерильным вазелиновым маслом. Заметный рост анаэробов (помутнение) может наблюдаться через 48 ч и более в зависимости от количества посевного материала.

Рост изолированных колоний анаэробов можно получить при рассеве исследуемого материала по поверхности кровяно-сахарного агара, разлитого в чашки Петри. После посева чашки помещают в анаэростат. Исследуемый материал в убывающей концентрации можно засевать в высокий столбик агара. Образовавшиеся отдельные колонии анаэробов выделяют, распилив пробирку в месте роста. Колонии анаэробов для получения значительного количества биомассы отсевают затем на среду Китта — Тароцци. В качестве источника энергии для анаэробов используют глюкозу, добавление которой в питательную среду обязательно.

3. Вид (лат. species) — основная структурная единица биологической систематики живых организмов (животных, растений и микроорганизмов)^[1] —таксономическая, систематическая единица, группа особей с общими морфофизиологическими, биохимическими и поведенческими признаками, способная к взаимному скрещиванию, дающему в ряду поколений плодовитое потомство, закономерно распространённая в пределах определённогоареала и сходно изменяющаяся под влиянием факторов внешней среды.

Подви́ д (лат. subspecies, общепринятая аббревиатура subsp. или ssp.) в биологической систематике — это либо таксономический ранг ниже ранга вида, либо таксономическая группав таком ранге. Биовар - физиологический тип, внутриподвидовая категория для обозначения штамма или совокупности штаммов бактерий со сходными биохимич. или физиол. признаками;

Штамм (от нем. Stamm, буквально — «ствол», «основа») — чистая культура вирусов, бактерий, других микроорганизмов или культура клеток, изолированная в определённое время и в определённом месте.

Билет №25 1. Обезжиренное предметное стекло и бактериологическую петлю прожигают в пламени горелки. Пробирку с изучаемой культурой держат между указательным и большим пальцами левой руки. Петлю берут правой рукой, мизинцем правой руки прижимают пробку пробирки к ладони.Если мазок готовится с жидкой питательной среды, то каплю культуры на­носят петлей на предметное стекло.Если мазок делают из культуры с агара, то петлю с культурой вносят на предметное стекло и добавляют каплю физиологического раствора, в котором эмульгируют внесенный материал.Петлю обжигают в пламени горелки. Мазок должен быть тонким, рав­номерно растертым, округлой формы, размером 1, 5-2 см.2. Высушивание мазка производится при комнатной температуре.3. Фиксация мазка производится с целью: • Убить микробные клетки.
• Обеспечить лучшее прилипание микробов к предметному стеклу.
• Облегчить дальнейшее окрашивание.

Фиксация мазка в пламени горелки производится 3-кратно, действие пла­мени должно длиться 2 секунды.Для более нежной фиксации мазков крови, спирохет и простейших использующих химические фиксаторы: • Метиловый спирт в течении 5-и минут.
• Этиловый спирт (96°) в течении 10-и минут.
• Смесь Никифорова — в течении 10-15 минут.
• Ацетон — в течении 5-и минут.
• Пары формалина — в течении нескольких секунд.

4. Окраска препаратов

2. Чистая культура(аэробов)— это популяция микроорганизмов одного вида. Для выде­ления чистой культуры аэробов используют методы, основанные на:

1. Механическим разобщением бактериальных клеток;

2. Действии физических и химических факторов, оказывающих избира­тельное действие;

3. Способности некоторых бактерий размножаться в организме.

Метод Дригальского основан на механическом разобщение на поверхности плотной питательной среды микробов всех видов, входящих в состав исследуе­мого материала.

I этап.

1. Определение микробного состава исследуемого материала (приготовле­ние мазка, окраска по Граму).2. Посев в чашку Петри: одну каплю материала наносят на поверхность МПА и растирают шпателем. Не обжигая шпателя и не набирая нового мате­риала, засевают вторую и третью чашки.

3. Засеянные чашки переворачивают вверх дном и инкубируют в термостате 18-20 часов при температуре 37° С.

II этап.

1. Микроскопическое изучение колонки по величине, форме, окраске, ха­рактеру поверхности, краев, консистенции колонии.

2. Микроскопическое изучение одной исследуемой колонии (приготовле­ние мазка, окраска по Граму).

3. Оставшуюся часть колонии пересевают в пробирку со скошенным ога-ром.

4. Пробирку инкубируют в термостате 18-20 часов при температуре 37° С. III этап.

Проверка культуры на чистоту (макроскопическим — однородный рост, микроскопическим- однородные по морфологическим признакам и тинкториальным признакам клетки). Идентификация проводится по:

- ферментативным свойствам.

- антигенным свойствам фагочувствительности токсигенности и другим признакам

б)выделение анфэробов

этап — обогащение на среде Китт — Тароцци, предварительно прокипячен­ной в течение 30 минут.После посева среду прогревают 15 минут при 80°С для уничтожения вегетативных форм, споры анаэробов при этом сохраняются. II этап — получение изолированных колоний На средах Китт — Тароцци обнаружи­вается помутнение с пузырьками газа. Выделение чистой культуры проводится по одному из следующих методов:

А) по Цейсслеру — каплю материала со среды Китт — Тароцци засевают в чашку с кровяным агаром и распределяют материал шпателем, этим же шпате­лем производят посев во второй и третьей чашках;

Б) по Вейнбергу: каплю материала со среды Китт — Тароцци переносят в растопленный и слегка остуженный сахарный агар, затем набирают в трубки Виньял — Вейона и инкубируют в термостате. Ш этап — выделение чистой куль­туры на среде Китт — Тароцци.

Многие виды бактерий подразделяют по одному признаку на биологические варианты —биовары (син: биотипы).

Чистую культуру -бактерий получают для проведения диагностических исследований, которые заключаются в идентификации, т. е. определении родовой и видовой принадлежности выделенных бактерий. Это достигается путем изучения их морфологических, культуральных, биохимических и других признаков (см. схему 1).Морфологические и тинкториальные признаки бактерий изучают при микроскопическом исследовании мазков, окрашенных разными методами, и нативных препаратов.Культуральные свойства характеризуют питательные потребности, условия и тип роста бактерий на плотных и жидких питательных средах. Эти свойства устанавливаются по морфологии колоний и особенностям роста культуры.изучении систематики и изменчивости микроорганизмов;

диагностике для идентификации возбудителей порчи пищевых продуктов;

диагностике инфекционных болезней; в микробиологической промышленности в качестве исходного материала для получения ферментов, вакцин, антибиотиков, витаминов, стероидных гормонов и других продуктов; в пищевой промышленности: в виноделии, пивоварении, производстве молочнокислых продуктов и хлеба.Для получения чистых культур дрожжей, микроскопических грибов и микроорганизмов используются: капельный метод Линднера микроманипуляторный метод; выращивание из единственной колонии на агаре или желатине; метод влажной камеры Ганзена.

3. В России одним из первых микробиологов был Л. С. Ценковский (1822—1887), описавший большое число простейших, водорослей и грибов и сделавший вывод об отсутствии резкой границы между растениями и животными. Им также была организована одна из первых Пастеровских станций и предложена вакцина против сибирской язвы. Франц Шульц после стерилизации сосуда с настоем пускал туда воздух, пропущенный через карболовую кислоту, и не наблюдал развития там микроорганизмов. Чтобы избежать возражений, что кислота тоже лишает воздух жизненной силы, Шрёдер и фон Душ в1854 году пропускали воздух через хлопковый фильтр, а в 1860 Гофман и независимо от него в 1861 Шевре и Пастер показали, что нет необходимости и в фильтре — достаточно изогнуть соединяющие сосуд с атмосферой трубки, чтобы в нём после стерилизации не «зарождалась» жизнь. Так принцип omne vivum ex vivo (всё живое из живого) окончательно победил в биологии. Используя представления о невозможности самозарождения жизни, Луи Пастер в 1860-х показал что стерилизация делает брожение невозможным, таким образом было доказано участие в нём микроорганизмов. Кроме того, это стало открытием новой формы жизни — анаэробной, не требующей кислорода, а иногда даже гибнущей под его воздействием.

Постепенно складывалось и осознание особого положения микромира в живой природе. В начале XIX века микроорганизмы причислялись к червям. В 1866 Эрнст Геккель впервые выделил их в отдельное царство Protista. Затем Ф. Кон в 1875, изучаясинезелёные водоросли, отграничил их от растений и объединил их с бактериями как наиболее простых из существующих организмов. К концу XIX века стало ясно, что протисты, объединяемые по своим микроскопическим размерам, существенно различаются между собой. Они были разделены на «высшие» (простейшие, микроскопические грибы и водоросли, дрожжи) и «низшие» (бактерии и синезелёные водоросли). Лишь в 1930-х после новых открытий в строении клетки Э. Шаттон предложил термины эукариоты и прокариоты. Отсекаются и приписываемые микроорганизмам «уникальные» свойства, одним из которых была способность самозарождаться. Другим был их плеоморфизм, то есть нераспространение на бактерий закона Линнея о постоянстве видов. Её появление было вызвано бедностью внешних форм бактерий при богатстве физиологических и биохимических свойств, отчего и казалось что одна та же бактерия проявляет себя по-разному. Особую роль в опровержении этой теории также сыграл Кон.

1 880-е и 1890-е ознаменовались для микробиологии всплеском числа открытий. Во многом это было связано с подробной разработкой методологии. Прежде всего здесь следует отметить вклад Роберта Коха, создавшем в конце 1870-х — начале 1880-х ряд новых методов и общих принципов ведения исследовательской работы. Пастер использовал для выращивания микроорганизмов жидкие среды, содержащие все элементы, находимые в живых организмах. Жидкие среды, однако, были недостаточно удобны. Так, сложно было выделить колонию, происходящую от одной живой клетки («чистая культура»), в связи с чем можно было изучать только обогащённые самой природой культуры. Лишь в 1883 Э. Христианом Гансеном была получена первая чистая культура дрожжей, полученная методом висячей капли. Твёрдые среды впервые использовались для изучения грибов, где необходимость чистых культур также была обоснована. Для бактерий твёрдые среды применял Кон во Вроцлаве зимой 1868/69годов, однако только в 1881 Роберт Кох положил начало широкому применению желатиновых и агаровых пластинок. В 1887 году введены в практику чашки Петри. Коху принадлежат также знаменитые постулаты:

возбудитель заболевания должен регулярно обнаруживаться у пациента;

он должен быть выделен в чистую культуру;

выделенный организм должен вызывать у подопытных животных те же симптомы, что и у больного человека.

Эти принципы были приняты не только в медицине, но и в экологии для определения вызывающих те или иные процессы организмов. Также Кох ввёл в применение методы окраски бактерий (ранее использованные в ботанике) и микрофотографию. Публикации Коха содержали в себе методики, принятые микробиологами всего мира. Вслед за ним началось развитие и обогащение методологии, так в 1884 Ганс Христиан Грам использовал метод дифференцирующего окрашивания бактерий (Метод Грама), С. Н. Виноградский в 1891 применил первую элективную среду. За следующие годы было описано больше видов чем за все предыдущее время, выделены возбудители опаснейших заболеваний, обнаружены новые процессы, производимые бактериями и неизвестные в других царствах природы.

Изучением брожения Пастер занялся с 1857 года. В то время господствовала теория, что этот процесс имеет химическую природу (Ю. Либих), хотя уже публиковались работы о его биологическом характере (Ш. Каньяр де Латур, 1837), не имевшие признания. К 1861 году Пастер показал, что образование спирта, глицерина и янтарной кислоты при брожении может происходить только в присутствии микроорганизмов, часто специфичных.

Луи Пастер доказал, что брожение есть процесс, тесно связанный с жизнедеятельностью дрожжевых грибков, которые питаются и размножаются за счет бродящей жидкости. При выяснении этого вопроса Пастеру предстояло опровергнуть господствовавший в то время взгляд Либиха на брожение, как на химический процесс. Особенно убедительны были опыты Пастера, произведенные с жидкостью, содержащей чистый сахар, различные минеральные соли, служившие пищей бродильному грибку, и аммиачную соль, доставлявшую грибку необходимый азот. Грибок развивался, увеличиваясь в весе; аммиачная соль тратилась. По теории Либиха, надо было ждать уменьшения в весе грибка и выделения аммиака, как продукта разрушения азотистого органического вещества, составляющего фермент. Вслед за тем Пастер показал, что и для молочного брожения также необходимо присутствие особого «организованного фермента» (как в то время называли живые клетки микробов), который размножается в бродящей жидкости, также увеличиваясь в весе, и при помощи которого можно вызывать ферментацию в новых порциях жидкости.В это же время Луи Пастер сделал ещё одно важное открытие. Он нашёл, что существуют организмы, которые могут жить безкислорода. Для некоторых из них кислород не только не нужен, но и ядовит.