Билет №25

Вопрос 1. Приготовление фиксированных препаратов-мазков. Для приготовления препарата на обезжиренное предметное стекло наносят каплю воды или изотонического раствора хлорида натрия, в которую петлей вносят исследуемый материал и распределяют его таким образом, чтобы получить тонкий и равномерный мазок. При таком распределении материала в мазке при микроскопии можно увидеть изолированные бактериальные клетки. Если исследуемый материал содержится в жидком виде, то его непосредственно наносят петлей на предметное стекло и готовят мазок. Мазки высушивают на воздухе или в струе теплого воздуха над пламенем горелки, не давая капле закипать.

Для фиксации мазка предметное стекло (мазком вверх) медленно проводят 3 раза через пламя горелки. Микроорганизмы при фиксации погибают, плотно прикрепляясь к поверхности стекла, и не смываются при дальнейшей обработке. Более длительное нагревание может вызвать деформацию клеточных структур. Мазки крови, мазки-отпечатки органов и тканей и в некоторых случаях мазки из культур микроорганизмов фиксируют погружением на 15-20 мин. в метиловый или этиловый спирт, смесь Никифорова, сулемовый спирт и другие фиксирующие жидкости.

Вопорс 2. Выделение чистых культур бактерий. Метод Пастера. Из исследуемого посевного материала делается ряд последовательных разведений в жидкой питательной среде: капля посевного материала вносится в колбу или пробирку со стерильным МПБ, из нее каплю переносят в следующую пробирку и так до 8-10 колб или пробирок, которые термостатируют при оптимальной температуре. С каждым разведением количество микробных клеток, попадающих в среду, будет уменьшаться. В жидких средах микроорганизмы растут диффузно, т.е. легко распространяются по всей толще среды, что не всегда обеспечивает получение чистой культуры. В настоящее время этот метод не применяется, а используется только для предварительного уменьшения концентрации микроорганизмов в материале перед его посевом на плотную питательную среду Метод Дригальского (метод фракционного посева). Этот метод основан на механическом разобщении микробных клеток друг от друга на поверхности плотной питательной среды. Каждая микробная клетка, фиксируясь в том месте, куда она попала, начнет размножаться и через 1-2 дня образует колонию. Используют несколько чашек Петри (чаще 3) с залитой в них плотной питательной средой (МПА). На поверхность застывшей среды в первую чашку вносят каплю исследуемого материала, содержащего микроорганизмы. Затем с помощью стеклянного шпателя ‑ бактериологической петли каплю растирают по всей поверхности агара после чего этим же шпателем (не обжигая его) проводят по поверхности среды во второй и в третьей чашках. В процессе растирания микробные клетки разъединяются друг от друга. После посева на крышках чашек делают надпись: наименование исследуемого материала или номер анализа посева и номер чашки, фамилия студента Из изолированных колоний выделяют чистую культуру. Метод фильтрации. Основан на пропускании исследуемого материал через специальные мелкопористые фильтры с определенным диаметром пор и разделении содержащихся микроорганизмов по величине. Этот метод применяется, главным образом, для очистки вирусов от бактерий. Метод обогащения применяют для выделения чистых культур различных микроорганизмов (например, сальмонелл). Для этого производят посев исследуемого материала на питательные среды, способствующие росту определенного микроба. Такие среды называются элективными, например среды Кауфмана, Мюлера для выделения сальмонелл из сильно загрязненного материала. В состав этих сред входят химические вещества, подавляющие рост посторонней микрофлоры и не препятствующие росту сальмонелл. Для молочнокислых бактерий средой обогащения является ‑ ­ обезжиренное молоко, развиваясь в котором они образуют молочную кислоту, подавляющие посторонние микроорганизмы.

Изучение биохимических свойств. О наличии того или иного фермента судят по способности микроорганизма воздействовать на известный субстрат. Присутствие фермента выявляют по изменению физического состояния субстрата (разжижению желатина), закислению питательной среды (среды Гисса с углеводами). Образованию определенных продуктов метаболизма (индол, аммиак, сероводород) и т.д.

Выявление сахаролитической активности. Сахаролитическую активность изучают по образованию микроорганизмами экзоферментов карбогидраз (глюкозидаз), по интенсивности образования органических кислот и ароматических веществ. Для выявления сахаролитических ферментов исследуемую культуру засеивают в среду Гисса, которая содержит 5 моноуглеводов: глюкозу, лактозу, маннит, мальтозу, сахарозу. Сахара и спирты, используемые для сред Гисса, должны быть химически чистыми.

Для выявления протеолитических ферментов исследуемую культуру засеивают в питательную среду, содержащий тот или иной белок (МПЖ, молоко, свернутую кровяную сыворотку). Для идентификации видов существенное значение имеет выявление способности микробов гидролизовать белок до продуктов глубокого распада: индола, сероводорода, аммиака. Индол (орто-бензопирил) образуется при расщеплении ферментом триптофаназой аминокислоты триптофана.

Источниками образования сероводорода могут быть различные соединения среды: органические и неорганические. Для определения образования сероводорода делают посев в пробирку с МПБ, в которую под пробку над средой помещают кусочек стерильной фильтровальной бумаги, пропитанной раствором уксуснокислого свинца. Если исследуемая культура при разложении белка выделяет сероводород, то образуется сульфид свинца, в результате чего появляется темно-бурое окрашивание фильтровальной бумажки. Присутствие аммиака определяют по изменению цвета красной лакмусовой бумажки (синеет), а также при помощи реактива Несслера.

Вопрос 3. Середина XIX века явилась поворотным этапом в развитии микробиологии. Луи Пастер является основоположником микробиологии как науки. Его пионерские исследования о брожении, выяснении роли микробов в круговороте веществ в природе и самопроизвольном зарождении составили теоретическую базу современной микробиологии. Пастер установил, что в определенных условиях культивирования патогенные микробы теряют свою вирулентность. На основе этого открытия он создает вакцины. Успехи медицинской микробиологии в области этиологии инфекционных болезней обусловили необходимость изучения механизмов защитных реакций организма от инфекционных агентов. Мечников – фагоцитоз. Рядом с именем Пастера встало имя Роберта Коха, выдающегося мастера прикладных исследований, он открыл возбудителя сибирской язвы, холеры, туберкулеза и других м/o.

Историческая роль в становлении микробиологии принадлежит исследованиям французского химика Л. Пастера. В процессе работ по обслуживанию сельского хозяйства и промышленности (скисание вина и пива, болезни шелковичных червей и др.)

В 1885 г. Пастером были проведены первые прививки против бешенства — лечебные и предохранительные.

Билет № 26 №1 Метод люминесцентной микроскопии основан на способности некоторых веществ светиться при воздействии коротковолнового излучения. При этом испускаемые световые волны длиннее волны, вызывающей свечение. Иными словами, флюоресцирующие объекты поглощают свет одной длины волны и излучают в другой области спектра (рис. 11-4). Например, если индуцирующее излучение синее, то образующееся свечение может быть красным или жёлтым. Эти вещества (флюоресцеин изоцианат, акридиновый оранжевый, родамин и др.) используют как флюоресцирующие красители для наблюдения флюоресцирующих (люминес-цирующих) объектов. В люминесцентном микроскопе свет от источника (ртутная лампа сверхвысокого давления) проходит через два фильтра.

Первый (синий) фильтр задерживает свет перед образцом и пропускает свет длины волны, возбуждающей флюоресценцию образца. Второй (жёлтый) задерживает синий свет, но пропускает жёлтый, красный, зелёный свет, излучаемый флюоресцирующим объектом и воспринимаемый глазом. Обычно исследуемые микроорганизмы окрашивают непосредственно либо с помощью AT (антител) или лектинов, помеченных флюоро-хромами. Препараты взаимодействуют с Аг или другими связывающими лиганд структурами объекта. Люминесцентная микроскопия нашла широкое применение для визуализации результатов иммунохимических реакций, основанных на специфическом взаимодействии меченных флюоресцирующими красителями AT с Аг (антиген) изучаемого объекта.

№2 Азотное питание

Источники азота - элемента необоходимого для синтеза белков, нуклеиновых кислот.Паразиты развиваются за счет органических азотосодержащих веществ.В зависимости от того, какими источниками азота микроорганизмы пользуются их подразделяют на 2 группы: 1. Аминоавтотрофные микроорганизмы, синтезирующие белковые вещества за счет минеральных источников азота или простейших форм органического азота типа мочевины.2. Аминогетеротрофные микроорганизмы способные синтезировать ряд аминокислот из простейших источников азота, но неспособные самостоятельно синтезировать какую-нибудь одну аминокислоту.Аминотрофные микроорганизмы при использовании азота из ряда минеральных источников предварительно переводят его в форму аммиака, а затем используют для синтеза аминокислот.

№3 Паразитируя на генетическом уровне как молекулы НК, вирусы, лишенные энергообменных систем, не могут, подобно бактериям, размножаться на искусственных питательных средах. Процесс их воспроизводства (репродукции) всецело обусловлен метаболизмом ограниченного круга чувствительных организмов и клеток, которые в вирусологии называют хозяевами. Выращивают вирусы в культурах клеток или тканей, 7—13-дневных куриных эмбрионах и организме лабораторных животных, среди которых чаще всего используются белые мыши, преимущественно 1-4-дневные сосунки, кролики, сирийские хомяки и африканские хорьки. Культура клеток - это выращенные in vitro (вне организма) на специальных средах клетки различных тканей животных и человека, в том числе лейкоциты, сохраняющие присущие им обмен и восприимчивость к определенным вирусам. Главное требование при работе с культурами клеток и вирусами - строгое соблюдение стерильности, которое достигается в асептических условиях вирусологического бокса.

Для выращивания клеток (тканей) применяют различные питательные среды (199 или Игла), содержащие полный набор необходимых им веществ (аминокислоты, пурины, пиримидины, углеводы, витамины и др.) с добавлением бычьей сыворотки.

Имеется много типов культур клеток: 1) первичные культуры, способные к 5-10-кратному пассированию; 2) неограниченно перевиваемые; 3) полуперевиваемые, представляющие собой морфологически однородные клетки легких и почек человека, сохраняющие в 50 пассажах диплоидный набор хромосом.

Все эти типы клеток выращивают при температуре 36-37 °С в ультратермостатах, получая в течение 5-7 суток хороший монослой в виде пласта, сцепленного со стенками матрацев, флаконов и пробирок. Контролируют рост клеток под малым увеличением микроскопа, начиная с 3-4 дня.

Первичные культуры клеток. Источником получения первичных культур клеток являются обладающие большой потенцией роста эмбриональные ткани птиц (главным образом куриные фибробласты), экспериментальных животных, обезьян, но чаще всего готовят их из трипсинизированных тканей абортированных 8-14-недельных плодов человека. Для этого ткань плода измельчают ножницами на мелкие кусочки размером 2-4 мм и 2-3 раза отмывают от крови буферным раствором Хенкса, пока жидкость не станет почти прозрачной.

Затем для разрушения межклеточного вещества кусочки ткани заливают подогретым до 32-37 °С 0, 25%-м раствором трипсина, и в смесителе на электромагнитной мешалке перемешивают взвесь в течение 10-30 мин. Первую порцию трипсинизированных клеток удаляют. Подходящие для культивирования вирусов клетки получают после повторных трипсинизации. Далее содержащую клетки жидкость для отделения крупных комочков ткани и соединительнотканных волокон фильтруют через марлю, центрифугируют при 800-1000 об/мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость сливают, осадок отмывают раствором Хенкса и разводят средой 199 (или Игла), чтобы получить в 1 мл 100 000-400 000 клеток. Взвесь клеток разливают по 1 мл в пробирки или по 20-100 мл в стеклянные матрацы, плотно закрывают резиновыми пробками и помещают в термостат при температуре 37 °С. Матрацы располагают в горизонтальном положении, а пробирки -под углом 5-10° в специальных лотках. Прикрепляясь к стеклу, клетки в течение нескольких суток образуют монослой.

Перевиваемые культуры клеток. Это стабильные или, как их нередко называют, иммортализованные (бессмертные) линии клеток, автономно размножающиеся, подобно бактериям. Получают их из нормальных тканей человека (амниона - FL, А-0, А-1; почек - Rh, 1ШЧ, диплоидных клеток); животных (почек обезьян - Vero, MS, BSC-1; почек кролика - ПК и его роговицы -SIRK) и злокачественных опухолей (шейки матки- HeLa, гортани - НЕр-2, полости рта - KB, костного мозга человека - Д-6 и др.), которые выращиваются путем последовательных пассажей на питательных средах вот уже многие десятки лет.