Б) Метод конглютинации с желатином

В пробирку помещают равные объемы исследуемых эритроцитов, антирезусной сыворотки и 10% раствора желатина. Пробирки инкубируют при температуре 45-48°С, после чего добавляют десятикратный объем физиологического раствора. Пробирки 2-3 раза переворачивают и учитывают результат по наличию агглютинации, видимой невооруженным глазом.

в) Непрямой антиглобулиновый тест (реакция Кумбса)

Эта реакция является наиболее чувствительной для выявления не-полных антител к ауто- и изоантигенам эритроцитов. К ней, как правило, прибегают при возникновении трудностей в определении резус-принадлежности крови, связанных с нечеткими результатами, полученными при других методах исследования. Реакция основана на использовании антиглобулиновой сыворотки (АГС).

При обработке резус-положительных эритроцитов неполными антителами анти-Rh наступает их обволакивание (сенсибилизация) по отношению к АГС, которая и агглютинирует сенсибилизированные эритроциты, поскольку имеет антитела к глобулинам. В пробирку вносят антирезусную сыворотку и отмытые физиологическим раствором эритроциты; помещают на 1 час в термостат при температуре 37°С, после чего эритроциты тщательно отмывают. Последующий этап реакции проводят на плоскости. Каплю взвеси эритроцитов смешивают с равным количеством антиглобулиновой сыворотки и учитывают результат. Наличие агглютинации является показателем того, что исследуемый образец крови резус-положительный. Если агглютинация отсутствует, испытуемая кровь — резус-отрицательная.

г) определения резус-принадлежности крови человека на основе моноклональных антител «Анти D Супер ЦОЛИКЛОН»⁴

Назначение:

Анти-D Супер Цоликлон - жидкий диагностический реагент для определения резус-принадлежности крови человека - предназначен для качественного выявления в эритроцитах человека Rh(D)-антигена системы «резус». Применяется в учреждениях службы крови, клинико-диагностических лабораториях и в научно-исследовательской практике. Набор расчитан на проведение 1000 определений при расходе по 0.1 мл реагента на 1 анализ.

Принцип метода:

Основным принципом метода типирования крови при помощи моноклональных антител является реакция антиген-антитело Активные центры антител определенной специфичности связываются с мембранными антигенами эритроцитов крови, что вызывает агглютинацию (склеивание) эритроцитов, легко наблюдаемое визуально. Наличие агглютинации эритроцитов исследуемой крови человека под действием моноклональных антител определенной специфичности однозначно свидетельствует о том, что данные эритроциты несут антиген данной специфичности.

Состав реагента.

Реагент Анти-D Супер Цоликлон, представляет собой раствор анти-D моноклональных антител в 0.2 % растворе NaС1 с добавлением 2% 6ычьего сывороточного альбумина, 7 % глюкозы и азида натрия (0, 1%) в качестве консерванта.

Аналитическая характеристика реагента.

Анти-D Супер Цоликлон - жидкий диагностический реагент для определения резус- принадлежности крови человека - представляет собой раствор полных антител, относящихся к иммуноглобулинам класса М (IgМ-антитела), специфичности анти-D. Титр (концентрация) антител в реагенте Анти-D Супер Цоликлон соответствует значению 1: 256 в прямой реакции агглютинации с D -положительными эритроцитами в микроплате при титровании 2% раствором бычьего сывороточного альбумина (титр 1: 32 в прямой реакции агглютинации D -положительных эритроцитов на плоскости). Активность (гемагглютинирующая активность) - 60 секунд. В реакции используется по 0, 1 мл реагента и примерно 0, 05 - 0, 01 мл крови или эритроцитов. Воспроизводимость результатов резус-типирования крови человека реагентом. Анти-D Супер Цоликлон - 100 %. Результат типирования не зависит от форм антигена D в исследуемых эритроцитах (сильные или слабые).

Анализируемые пробы.

Анализ может проводиться с образцами нативной крови или эритроцитов, полученных из венозной, артериальной или капиллярной крови, как взятой в консервант, так и без консерванта.

Следует избегать загрязнения анализируемого образца эритроцитами из другой пробы, т.к. вследствие высокой чувствительности реагентов сравнительно небольшое количество иммуно-активных загрязнений может привести к ложно-положительной реакции.

Срок пригодности образцов крови человека для их типирования с помощью Цоликлонов ограничен 7 сутками хранения при температуре +2 °...+8° С.

Меры предосторожности.

Компоненты реагента Анти-D Супер Цоликлон в используемых концентрациях не токсичны и не требуют соблюдения специальных мер безопасности при работе с ними.

Работа с образцами крови требует использования одноразовых пластиковых или резиновых перчаток, т.к. исследуемые образцы могут содержать вирусы гепатитов, ВИЧ или другой гемоконтактной инфекции (Приказ № 408 Минздрава СССР от 12 июля 1989 года).

Оборудование и материалы, необходимые при работе с набором

- керамические пластинки (плитка облицовочная) однотонные, светлые с чистой сухой обезжиренной поверхностью; возможно использование различных типов планшетов для определения групп крови (Использование применявшихся раннее специальных шариков в планшетах для определения групп крови человека не рекомендуется);

- круглодонные планшеты для иммунологических реакций;

- пипетки вместимостью 0, 1 мл;

- пробирки стеклянные или пластиковые с анализируемыми образцами крови, маркированные, в штативе;

- одноразовые пастеровские пипетки пластиковые или стеклянные для нанесения на пластинку капель тестируемых образцов крови;

- палочки стеклянные для смешивания реагента с образцом крови;

- водяная баня или термостат, поддерживающие температуру + 45°... +50°С;

- физиологический раствор;

- раствор желатина 10 %.

Подготовка реагента для анализа.

Реагент полностью готов к работе и специальной подготовки не требует.

Проведение анализа.

На проведение одного анализа резус-принадлежности крови человека (типирование 1 образца) расходуется примерно 0, 1 мл Анти-D Супер Цоликлона. При использовании неградуированных пипеток 0, 1 мл -1 полная капля. Анализы следует проводить в помещении с хорошим освещением и температурой +15°…+30°С.

Моноклональные анти-D IgМ антитела Анти-D Супер Цоликлона могут быть использованы для выявления D-антигена системы резус в любых модификациях прямой реакции агглютинации: на плоскости, в пробирке, в микроплате. Тестирование резус-принадлежности крови человека любым из этих методов не требует дополнительной перепроверки и позволяет надежно выявлять даже слабые формы D-антигена системы резус. В случае выявления данным реагентом резус-отрицательного донора можно провести подтверждение полученного результата тем же реагентом а реакции конглютинации с желатином, изоиммунной сывороткой или цоликлоном анти-D производства ООО «Гематолог» или фирм «ВIOТЕSТ АG» (Германия), «Ortho Diag.» (США). Это позволит гарантированно избежать случайных ошибок учета результата при тестировании методом прямой реакции агглютинации на плоскости в редких случаях особо слабых форм D - антигена, при которых агглютинация может быть выражена слабо (т.н. «песочная агглютинация») или развиваться медленнее, чем за 3 минуты. Заключение о присутствии D-антигена в исследуемых эритроцитах делают по наличию положительной реакции агглютинации.

Непрямая реакция агглютинации

На плоскости:

На смачиваемую (обезжиренную) поверхность светлой керамической пластинки нанести одну каплю (0, 1 мл) Анти-D Супер Цоликлона. Рядом поместить маленькую (10 мкл) каплю исследуемой крови и смешать каплю Цоликлона с каплей крови индивидуальной чистой стеклянной палочкой. Реакция агглютинации развивается уже через 30 секунд при мягком покачивании пластинки, практически полностью реакция проходит за 60 секунд. Результаты учитываются через 3 минуты после смешивания капель, поскольку реакция агглютинации эритроцитов, несущих слабую форму D - антигена протекает медленнее. Положительный результат тестирования выражается в появлении агглютинации (склеивания) эритроцитов, которую можно наблюдать невооруженным глазом, поскольку капля быстро просветлятся, а эритроциты образуют крупные, хорошо различимые ярко-алые агрегаты. При отрицательном результате гемагглютинация не развивается, капля продолжает оставаться равномерно окрашенной в красный свет, агрегаты в ней не обнаруживаются.

В пробирке: В пробирку вносят 2 капли (по 0, 1 мл) реагента Анти-D Супер Цоликлона и добавляют к нему 1 каплю 5 % взвеси отмытых в физиологическом растворе эритроцитов исследуемой крови. Содержимое пробирки тщательно перемешивают встряхиванием и инкубируют в течение 30-45 минут при комнатной температуре (+18°...+25°С}. Затем пробирку центрифугируют при 1500-2000 об/мин. в течение 1 минуты. Осадок мягко взвешивают, покачивая пробирку, и по наличию агглютинатов, выявляемых визуально и под микроскопом, делают заключение о присутствии D - антигена.

В микропланшете:

В лунку круглодонного микропланшета вносят 50 мкл Анти-D Супер Цоликлона и 50 мкл 2% взвеси отмытых в физиологическим растворе эритроцитов исследуемой крови, перемешивая пипетированием. Через 45-60 минут инкубации при комнатной температуре визуально учитывают реакцию агглютинации по характеру осадка эритроцитов на дне лунки: при отрицательном результате осадок эритроцитов на дне лунки имеет вид точки с четко очерченными краями, при положительном - устилает все дно лунки, край имеет неровный, часто - завернутый внутрь. Реакция конглютинации с желатином.

В пробирку вносят 1 каплю (0, 1 мл) отмытых эритроцитов. Затем добавляют 2 капли (0, 2мл) 10 % раствора желатина, предварительно прогретого в бане или термостате до разжижения при температуре +45°...+50°С, и одну каплю (0.1 мл) Анти-D Супер Цоликлона. Смесь тщательно перемешивают, инкубируют 10-15 минут на водяном бане или в течение 30 минут в термостате при температуре + 48°С, прибавляют 5 - 6 мл физиологического раствора. Наличие агглютинации определяют визуально после осторожного переворачивания пробирки. Агглютинация эритроцитов свидетельствует о наличии в них D-антигена.

ВОЗМОЖНЫЕ ОШИБКИ

Чаще всего ошибки являются следствием методических погрешностей при проведении исследования, в особенности при использовании конглютинационных методов. К ложным результатам может привести неправильное соотношение между сывороткой и эритроцитами, преждевременная оценка результатов, оценка результатов по высыхающей капле, определение резус-фактора в гемолизированном и длительно хранящемся образце крови, а также использование неактивных, инфицированных и загнивших сывороток, использование сывороток с истекшим сроком годности.

Причиной ошибок могут быть биологические особенности испытуемой крови: снижение агглютинабельности резус-антигена при некоторых заболеваниях печени, почек, системы крови, а также неспецифическая агглютинация испытуемых эритроцитов. В случае сомнительных результатов исследование повторяют, применяя более активные антирезусные сыворотки.