У микроорганизмов 1 страница

Основы регуляции метаболизма

(специальность " Микробиология")

Методические указания к практическим занятиям

Киров 2005

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

Освоение дисциплины " Основы регуляции метаболизма микроорганизмов" является важным этапом подготовки специалистов - микробиологов и инженеров - биотехнологов.

Цель преподавания - ознакомить студентов с основными понятиями и закономерностями регуляции метаболизма микроорганизмов с учетом новейших достижений фундаментальной и прикладной науки.

Задачей практических занятий является изложение методологических подходов к решению научных проблем изучения регуляции метаболизма микроорганизмов, закрепление студентами теоретического материала в процессе коллективного обсуждения и анализа методологии практических работ с культурами микроорганизмов и ферментными препаратами, а также решение расчётных задач по кинетике ферментативных реакций.

Практические занятия дисциплины должны содействовать закреплению студентами теоретических знаний и дополнению их специальными знаниями в области методологии исследовательских и лабораторно - производственных работ с культурами микроорганизмов и ферментными препаратами.

Курс лекций и практических занятий проводится в 7 семестре после получения студентами фундаментальной подготовки по теоретическим разделам биохимии, биофизики и микробиологии, цитологии микроорганизмов, основам генетики, энзимологии и биотехнологии, прикладной молекулярной биологии.

ПОРЯДОК ПРОВЕДЕНИЯ ЗАНЯТИЯ

1 Вводная часть - 5 минут.

2 Разбор основных терминов и определений по теме занятия - 10 минут.

3 Собеседование по учебным вопросам - 45 минут.

4 Решение расчётной задачи - 25 минут.

5 Подведение итогов занятия - 5 минут.

ЗАНЯТИЕ 1

МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ МЕТАБОЛИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ. ПОДГОТОВКА КЛЕТОК К АНАЛИЗУ. МЕТОДЫ ИЗМЕРЕНИЯ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ. РАСЧЁТНЫЕ ЗАДАЧИ.

ВВОДНАЯ ЧАСТЬ

Конечной целью изучения ферментных систем бактерий является получение исчерпывающей информации о различных реакциях, протекающих в клетках, которая позволила бы понять, как эти реакции вплетены в ткань жизненных процессов. В идеале такие исследования должны проводиться на растущих клетках с интактной структурой и ненарушенным метаболизмом. Во многих случаях это удается осуществить, однако чаще всего приходится использовать менее идеальный источник получения клеточных компонентов.

Прежде всего исследователь должен решить, какой тип препарата больше всего соответствует целям эксперимента. И, хотя уже проведено огромное количество экспериментов на сотнях различных штаммов бактерий, очень трудно сформулировать какие-либо определенные рекомендации относительно выбора «наилучшего» метода. Здесь применимо только правило оптимального выбора: использовать препараты дезинтегрированных клеток в тех случаях, когда их невозможно сделать проницаемыми, и делать клетки проницаемыми, если нет возможности работать с интактными покоящимися или растущими клетками.

ОСНОВНЫЕ ТЕРМИНЫ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Обменом веществ, или метаболизмом называется совокупность протекающих в клетке процессов, обеспечивающих воспроизводство биомассы микроорганизмов. Клеточный метаболизм прокариот складывается из двух потоков реакций, имеющих разную направленность: энергетического и конструктивного метаболизма.

Ферменты - белковые комплексы, с участием которых протекают в микробной клетке все обменные процессы, они состоят из двух частей:

1) однокомпонентная, или белковая группа, в состав которой входит белок-носитель (апофермент);

2) простетическая, или активная группа (кофермент).

В отдельности белковая и простетическая группы не обладают ферментативной активностью и только после соединения приобретают свойства ферментов, для которых характерны: специфичность действия, термолабильность, зависимость от реакции среды (рН). Экзоферменты выделяются в окружающую среду, где производят превращение питательных веществ в более простые соединения. Эндоферменты прочно связаны с цитоплазмой, осуществляют дальнейшее расщепление поступающих питательных веществ и превращение их в составные части клетки.

Скорость роста микроорганизмов - функция скоростей координированного биосинтеза всех компонентов биомассы и скорости клеточного деления - регулируется на многих этапах метаболизма.

«Узкое место» - один из участков сложной сети биохимических реакций, в определенных условиях лимитирующий общую скорость метаболизма и, даже в оптимальных условиях роста, лимитирующий скорость размножения клеток. Выявление такого «узкого места» чрезвычайно важно для получения максимального выхода биомассы и ценных для человека продуктов метаболизма в случае использования микроорганизмов в биотехнологических процессах.

СОДЕРЖАНИЕ УЧЕБНЫХ ВОПРОСОВ

1. ПОДГОТОВКА БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК К АНАЛИЗУ

1.1 ИНТАКТНЫЕ КЛЕТКИ

1.1.1 Растущие клетки

Все основные жизненные процессы, протекающие в активно растущих бактериях, включая размножение, имеют высокоорганизованный и строго регулируемый характер и во многих отношениях представляют собой идеальную систему для исследования ферментов. Во время роста клеток все их метаболические системы находятся в подвижном равновесии: питательные вещества и ионы поступают в клетки, а конечные продукты метаболизма выводятся. Во всех случаях, когда это возможно, желательно использовать интактные растущие клетки.

1.1.2 Покоящиеся клетки

Рост клеток можно остановить, если отделить их (путем центрифугирования или фильтрации) от питательной среды и суспендировать в «нейтральной», осмотически подходящей среде, например забуференном физиологическом растворе или минерально-солевой среде, лишенной источников углерода и азота. Обработанные таким образом клетки называются покоящимися. Они обладают тем же набором ферментов, что и растущие клетки, но находятся в относительно неактивном состоянии. На таких клетках можно изучать реакции или группы реакций, представляющие особый интерес. Например, можно определять поток электронов, идущий от субстратов, таких, как D-лактат или сукцинат, через систему дыхания в условиях, когда рост и метаболические требования минимальны. Покоящиеся клетки некоторых видов способны синтезировать белки, и их часто используют для изучения этого процесса. Кроме того, покоящиеся клетки служат объектом при изучении транспортных процессов, включая транслокацию субстратов и ионов. С этой целью отмытые клетки обычно суспендируют в осмотически пригодной среде, содержащей для подавления синтеза белка хлорамфеникол (50-100 мкг/мл). При проведении некоторых экспериментов, например связанных с изучением транспорта, часто рекомендуется использование эндогенных источников энергии.

1.1.3 Голодающие покоящиеся клетки

Бывают случаи, когда клетки полностью лишают эндогенных источников энергии. Прекрасный пример использования голодающих покоящихся клеток - измерение внутриклеточного АТР, образующегося за счет хемиосмотического мембранного потенциала. В неголодающих клетках выявление АТР, синтезированного за счет хемиосмотического градиента, затруднительно из-за высокого фонового уровня АТР. Методика голодания для Е. coli была разработана Кохом. При ее использовании клетки Е. coli быстро утилизируют резервные питательные вещества в циклическом процессе фосфорилирования/дефосфорилирования α -метилглюкозида, который у этих бактерий фосфорилируется при участии фосфоенолпируват-фосфотрансферазной системы. Клетки собирают центрифугированием при 4°С и промывают основной средой или 0, 12 М трис-НС1, рН 8, 0. Затем их суспендируют до плотности 5 мг клеток (сухого веса) на 1 мл основной среды, содержащей 20 мМ α -метилглюкозида и 40 мМ азида натрия, и инкубируют при 37°С от 45 до 120 мин в зависимости от используемого штамма. После этого клетки снова центрифугируют, промывают и ресуспендируют в соответствующем растворе.

Более обычный способ подавления эндогенного метаболизма, по крайней мере у аэробов или факультативных аэробов, заключается просто в энергичном аэрировании густой суспензии клеток (в основной среде или буфере) в течение 2-4 ч или дольше, если это необходимо. За сокращением запасов питательных веществ в клетках можно следить, измеряя максимальное снижение эндогенного дыхания Q (О₂) относительно уровня Q (О₂), необходимого для окисления какого-либо субстрата, например глюкозы.

1.2 ПРОНИЦАЕМОСТЬ КЛЕТОК

Работа с интактными клетками имеет свои трудности. Главная трудность заключается в том, что как растущие, так и покоящиеся клетки непроницаемы для большинства субстратов, кофакторов и метаболитов, обычно используемых при определении ферментов. Принято считать, что лучше всего изучать ферментативные реакции в условиях, когда белок-белковые (или белок-мембранные) взаимодействия между молекулами одного фермента (гомологичные взаимодействия) или между молекулой данного фермента и молекулой другого белка (гетерологичные взаимодействия) подобны тем, которые существуют in situ. Хотя при использовании интактных клеток данное условие выполняется, это малоутешительно, если необходимые субстраты не могут проникать через клеточную мембрану.

1.2.1 Обработка растворителями

Существует ряд методик, позволяющих более или менее успешно делать целые клетки более проницаемыми и тем самым использовать их для исследования ферментов. Например, при обработке клеток Е. coli растворителями (толуолом или бензолом) они становятся проницаемыми для β -галактозидов, которые проникают в клетки и подвергаются гидролизу (3-галактозидазой. Растворители применяются также при определении фосфоенолпируват-фосфотрансферазной системы у Е. coli. Для обработки клеток используются также различные растворы толуола в этаноле. Иногда такая обработка сопровождается замораживанием и оттаиванием клеток.

1.2.2 Обработка хелатообразующими агентами

Обработка энтеробактерий хелатобразующим агентом (трис-ЭДТА) была успешно применена для того, чтобы сделать их проницаемыми и, следовательно, чувствительными к актиномицину D. Рекомендуется шире применять такую обработку при изучении сложных систем, таких, как ферменты, связанные с мембранами, и ферменты взаимопревращения. Более того, везде, где это возможно, следует сравнивать ферментативные активности обработанных и интактных клеток.

1.3 ПРЕПАРАТЫ ДЕЗИНТЕГРИРОВАННЫХ КЛЕТОК

Во многих случаях целые клетки, как проницаемые, так и непроницаемые, бывают непригодны или слишком сложны для исследований, и тогда приходится прибегать к дезинтегрированным клеточным препаратам.

1.3.1 Разрушение клеток под действием осмотических сил

Бактериальные клетки разрушают различными способами. Пожалуй, самым мягким из всех механических способов разрушения клеток является разрушение клеточной мембраны под действием гидростатического (осмотического) давления. Для большинства бактерий этот метод неприменим, если не обрабатывать предварительно клеточные стенки ферментами или не изменять их структуру другими способами.

Применение осмотического шока оказалось очень полезным при изучении некоторых ферментов грамотрицательных бактерий. Эти ферменты локализуются между плазматической мембраной и наружными слоями клеточной стенки в периплазматическом пространстве, и поэтому их называют «периплазматическими» ферментами. Обычно это гидролазы, такие, как щелочная фосфатаза, рибонуклеаза I и циклическая фосфодиэстераза. Метод включает следующие этапы:

1) тщательное промывание клеток свежей средой или соответствующими буферами;

2) суспендирование промытого осадка клеток в растворе 0, 5 М сахарозы (80 частей);

3) центрифугирование и декантирование надосадочной фракции;

4) быстрое диспергирование осадка путем сильного встряхивания в холодном 5-10^{-4 М растворе} MgCl₂ (80 частей);

5) центрифгирование и изучение надосадочной фракции с целью выявления периплазматических ферментов.

Обработка смесью лизоцим - ЭДТА также является прекрасным способом быстрого и мягкого лизиса грамотрицательных клеток. Ее проводят при низкой или комнатной температуре. В осмотически щадящей среде (для того, чтобы не произошло полного разрушения клеток) при этом образуются сферопласты. Таким способом можно одновременно обрабатывать до 30 л клеток. С помощью этой мягкой обработки можно выделить всю фракцию полирибосом. Для оптимального раз рушения клеток бактерий различных видов используют разные концентрации растворов буфера, ЭДТА и лизоцима. Приведенная ниже методика первоначально была описана Репаске для разрушения клеток Е. coli. Промытые клетки суспендируют в 3 мл смеси, содержа щей 100 М трис-HCl, рН 8, 0, 0, 8 мг ЭДТА, рН 7, 5, 50 мкг лизоцима и воду. Лизис начинается после добавления лизоцима; его можно проводить при комнатной температуре в течение 5 мин или же на холоду.

Мягкая осмотическая обработка применяется также при выделении протопластов и мембранных везикул грамположительных бактерий. Выделенные с ее помощью препараты чрезвычайно полезны при изучении транспорта веществ через бактериальную мембрану.

1.3.2 Дезинтеграция

Из всех имеющихся средств эффективными для разрушения клеток бактерий (и дрожжей) являются пресс Френча или подобные ему устройства, вибрационные мельницы, ультразвуковые дезинтеграторы, некоторые ручные мельницы и пресс Хьюза. Большинство других устройств предназначено для специальных целей или же эффективно при обработке организмов, которые разрушаются легче, чем бактерии (например, ткани простейших или ткани животных). Наиболее полезный и эффективный химический способ дезинтеграции клеток включает использование литических агентов (таких, как лизоцим или лизоцим в сочетании с хелатобразующими агентами, например ЭДТА), Ниже кратко описаны наиболее подходящие приборы, используемые в настоящее время для разрушения клеток в бактериальной энзимологии.

Способ разрушения клеток выбирают в основном эмпирически в зависимости от вида клеток, нужного объема экстракта, чувствительности фермента(ов) к инактивации или изменению в процессе разрушения и необходимости последующего хранения. Часто это приходится делать методом проб и ошибок.

2. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ МЕТАБОЛИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ

2.1 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ УСЛОВИЯ

Методы определения метаболической (ферментативной) активности микроорганизмов должны быть по возможности точными, чувствительными, непрерывными, удобными и специфическими для изучаемых реакций. Однако чаще всего выполняются далеко не все эти требования. Поэтому, прежде чем признать метод пригодным для использования, необходимо провести многочисленные контрольные и стандартные тесты.

2.1.1 Изменяющиеся условия эксперимента

В большинстве случаев для определения активности ферментов каждого определенного вида микроорганизма нужны специальные условия. Нельзя применять один и тот же метод для изучения ферментов одного типа у различных видов бактерий. От вида к виду могут сильно различаться потребности бактерий в ионах и кофакторах, оптимумы рН и температуры, значения К м, чувствительности к ингибиторам и равновесия реакций. Классический пример такого типа вариаций - бактериальная сукцинатдегидрогеназа: условия определения активности этого фермента настолько варьируют, что авторы часто не указывают состав реакционной смеси.

2.1.2 Подавление активности

Если в неочищенном экстракте ферментативная активность не обнаруживается, это еще не означает, что организм, из которого приготовлен экстракт, не содержит этот фермент. Частичная или полная потеря активности фермента, присущей данному микроорганизму, может произойти во время приготовления экстракта. Внутри клетки фермент защищен от инактивации оксидантами и другими веществами окружающей средой и многочисленными белок-белковыми взаимодействиями, которые нарушаются в результате разрушения клеток. В связи с этим следует отметить, что содержание белка в большинстве клеток превышает 100 мг/мл. Однако чаще всего в анализах in vitro используют разбавленные водные растворы ферментов, так как в этих условиях легче осуществлять контроль в процессе эксперимента.

2.1.3 Конкурентные побочные реакции и сопряженный анализ

Определению ферментативной активности могут мешать конкурентные побочные реакции. Концентрации субстратов или образующихся веществ могут настолько сильно меняться в результате таких конкурентных реакций, что точное измерение активности становится невозможным.

Например, активность NADH-оксидазы или аденозинтрифосфатазы в неочищенных экстрактах может быть такой высокой, что определение образования или потребления NADH или АТР соответственно будет вызывать большие трудности. Необходимо либо учитывать побочные реакции путем соответствующего контроля, либо находить способы их подавления или нарушения.

2.1.4 Общие замечания

Комиссия по ферментам Международного биохимического союза рекомендует во всех случаях считать единицей ферментативной активности количество микромолей субстрата, потребляемого в 1 мин (или продукта, образующегося в 1 мин). На практике, однако, активность ферментов часто выражают в других единицах, взятых из оригинальных статей, опубликованных в различных журналах. Поэтому и в описанных ниже методиках приводятся различные единицы активности (в том виде, в котором они даются авторами). Однако, где это возможно, следует использовать активность ферментов в международных единицах. Каждая методика определения активности ферментов была разработана (в большинстве случаев) для определения конкретного фермента в данной бактерии (в частности, Е. соli, поэтому не будет излишним подчеркнуть, что условия, необходимые для получения максимальной активности фермента у бактерии одного вида, не обязательно окажутся оптимальными для того же фермента у бактерии другого вида. Применение методик без учета конкретных особенностей бактерий может привести к ошибочным выводам.

2.2. ОБЩИЕ МЕРЫ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ

При определении удельной активности фермента в клетках необходимо учитывать ряд факторов. Прежде всего, следует использовать насыщающие концентрации субстратов. В этом случае возможно определение количества единиц ферментативной активности, присутствующих в данном препарате, при условии линейной зависимости активности как от времени реакции, так и от количества присутствующего фермента. Выполнение этого условия проверяют эмпирически для каждого случая. В описываемых ниже экспериментах наглядно демонстрируется, какие именно способы применяют обычно для этой цели, а также каковы различия между ферментативной и удельной ферментативной активностью. Для опытного сотрудника эта разница очевидна, но для начинающего студента она может стать источником значительных затруднений.

2.3 ОБЩИЕ МЕТОДИКИ

Невозможно описать подробно все многочисленные способы определения различных ферментов. Достаточно сказать, что анализ может быть непрерывным, когда за реакцией наблюдают, не нарушая ее хода, или периодическим, т. е. связанным с периодическим отбором проб для измерения потребления субстрата или образования продукта. Например, фумаразу можно определять с помощью непрерывного анализа, применяя прямое спектрофотометрическое измерение или метод сопряжения с другой ферментативной системой. Предпочтительнее, однако, применять метод с периодическим отбором проб. Его осуществляют с помощью самых разнообразных способов, включая спектрофотометрический, манометрический, полярометрический и хроматографический. Проводят измерения также с помощью электродов и с использованием широкого набора химических агентов и изотопов.

С некоторыми из этих способов можно познакомиться самостоятельно на примере методик, в которых определяют активность ферментов каждого из шести классов: оксидоредуктаз, трансфераз, гидролаз, лиаз, изомераз и лигаз. Ферменты каждого из этих классов участвуют в регуляторных процессах метаболизма микроорганизмов.

3. РЕШЕНИЕ РАСЧЁТНЫХ ЗАДАЧ

Расчётные задачи выбираются и решаются из числа приведённых в ПРИЛОЖЕНИИ 1”

ЗАНЯТИЕ 2

МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ РЕГУЛЯЦИИ МЕТАБОЛИЗМА МИКРООРГАНИЗМОВ. РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ И СИНТЕЗА ФЕРМЕНТОВ.

РАСЧЁТНЫЕ ЗАДАЧИ

ВВОДНАЯ ЧАСТЬ

После точного, чувствительного и стандартизированного определения активности фермента можно переходить к выяснению вопроса о том, подвергается ли фермент одному или нескольким процессам регуляции метаболизма. Показано, что у бактерий существуют два основных типа регуляции ферментативной активности - аллостерический и ковалентная модификация.

Виды аллостерической регуляции ферментативной активности:

Простое ингибирование конечным продуктом

Кумулятивное ингибирование конечным продуктом

Последовательное ингибирование конечным продуктом

Стимуляция предшественником

Ингибирование предшественником

Стимуляция продуктом

Ингибирование продуктом

Регуляция с помощью энергетического заряда

Катаболитное ингибирование

Виды регуляции с помощью ковалентной модификации ферментов:

Фосфорилирование

ADP-Рибозилирование

Аденилирование

Уридилирование

Конверсия сульфгидрила

Названия видам аллостерической регуляции даны в соответствии с тем, какое положение занимает эффектор в метаболическом пути.

ОСНОВНЫЕ ТЕРМИНЫ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Регулирование – это поддержание значений параметров в заданных границах. В регулируемой равновесной системе отклонение от состояния равновесия приводит к возврату в исходное состояние. Стабилизация состояния неравновесной системы требует включения в её состав неравновесного механизма, осуществляющего регулирование, например, по принципу обратной связи.

Регуляция метаболизма – это управление скоростью биохимических процессов путем обратимого изменения количества белковых посредников, участвующих в этих процессах, или их активности.

Регуляция жизнедеятельности прокариотных организмов происходит на транскрипционном, трансляционном и метаболическом, субклеточном, клеточном и популяционном уровнях. Факторы, регулирующие активность ферментов, разнообразны по своей природе и подразделяются на следующие группы:

1) Химические факторы - делятся на несколько типов:

а) химические вещества, связывающиеся с активным (каталитическим) центром фермента (субстраты, кофакторы, конкурентные ингибиторы и др.);

б) химические вещества, связывающиеся с регуляторным центром фермента (аллостерические эффекторы);

в) химическая модификация молекулы фермента путем обратимого ковалентного связывания с другим ферментом.

2) Физические факторы (температура, давление, свет, магнитное поле, электрические импульсы) - оказывают менее специфическое действие, чем химические.

СОДЕРЖАНИЕ УЧЕБНЫХ ВОПРОСОВ

1. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ РЕГУЛЯЦИИ МЕТАБОЛИЗМА МИКРООРГАНИЗМОВ. РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ

При современном уровне биохимических знаний in vivo трудно анализировать процессы регуляции, а иногда и невозможно. Иногда возникает вопрос, действительно ли эти процессы имеют место в бактериальных клетках или они существуют лишь в воображении исследователя, но мы не будем здесь его обсуждать. К перечисленным выше видам регуляции следует относиться критически. При изучении аллостерической регуляции обычно проводят эксперименты in vitro. К реакционной смеси добавляют соединения, которые предположительно участвуют в регуляции - так называемые эффекторы, - и изучают их влияние на общий ход реакции. При аллостерических взаимодействиях влияние этих эффекторов наблюдается сразу же; оно обратимо и зависит от их концентрации. Для аллостерических ферментов график зависимости начальной скорости реакции от концентрации субстрата имеет сигмоидную форму, тогда как для обычных ферментов он имеет вид гиперболы.

В процессе регуляции ферментативной активности путем ковалентной модификации происходит ковалентное связывание лиганда с ферментом, а не простое обратимое, как при аллостерической регуляции. Это ковалентное связывание катализируется другим ферментом, как показано на рис.2. Активный (взаимно превращаемый) фермент превращается в неактивный с помощью другого фермента (инактивирующего), который ковалентно модифицирует первый. Другой фермент (активирующий) катализирует переход фермента в исходное активное состояние путем удаления появившихся ковалентных связей.

Эксперименты, иллюстрирующие оба типа регуляторных процессов (путем аллостерического и ковалентного связывания эффекторов), описаны ниже.

1.1 МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ АЛЛОСТЕРИЧЕСКОЙ РЕГУЛЯЦИИ МЕТАБОЛИЗМА МИКРООРГАНИЗМОВ.

1.1.1 Простое ингибирование конечным продуктом

Для определения треониндегидратазы (синтезирующего фермента Е. coli) можно использовать клеточные экстракты или лизированные клетки. Способность L-изолейцина аллостерически ингибировать этот фермент можно продемонстрировать в следующем эксперименте.

Пробирки с компонентами, перечисленными в табл. 1, инкубируют при 37°С до 20 мин (в зависимости от активности экстракта). Затем реакцию останавливают добавлением 0, 1 мл 50%-ной (вес/объем) ТХУ. Отбирают часть реакционной смеси (опять же в зависимости от активности фермента) и разбавляют ее водой до 1, 0 мл. Добавляют 3, 0 мл 0, 025%-ного раствора 2, 4-динитрофенилгидразина в 0, 5 М НС1 и оставляют смесь при комнатной температуре на 15 мин. Добавляют 1 мл 40%-ной КОН, встряхивают и измеряют оптическую плотность в колориметре Клетта - Саммерсона (фильтр 54) или в любом другом спектрофотометре или колориметре при 540 нм.

Таблица 1 – Приготовление проб для демонстрации ингибирования треониндегидратазы L-изолейцином

Количество микромолей a-кетобутирата, образовавшегося в реакционной смеси, определяют по ранее полученной калибровочной кривой. При такой постановке пробы могут содержать разное количество субстрата и эффектора. Результаты откладывают в виде кривой.

1.1.2 Аллостерическая регуляция с помощью энергетического заряда

Аткинсон предположил, что различные ключевые ферменты, участвующие в биоэнергетических и биосинтезирующих процессах, аллостерически регулируются в ответ на энергетический заряд клетки. Энергетический заряд равен сумме молярной фракции АТР и половины молярной фракции ADP (поскольку 2 моля ADP можно преобразовать в 1 моль АТР через аденилаткиназу), деленной на общее количество молей аденилатов: