У микроорганизмов 3 страница

Общая радиоактивность, присутствующая в культуре в конце периода роста, равна сумме всех этих радиоактивностей, за исключением радиоактивности углерода в газообразных продуктах (R_исх-G или S_H+A+E). Если все клетки удаляют центрифугированием в конце периода роста, то общая радиоактивность надосадочной фракции представляет собой лишь сумму радиоактивностей неиспользованного субстрата (S_Н) и негазообразных конечных продуктов (Е). Величина Е равна сумме всех веществ, элюированных из колонки с кремневой кислотой. Если это не так, то не исключено, что в растворе присутствует конечный продукт, не обнаруживаемый в указанных условиях.

Установив балансовые взаимоотношения и определив путь превращений углерода, можно сделать некоторые общие заключения, касающиеся биоэнергетических и биосинтетических путей метаболизма. Например, появление радиоактивности в клеточной фракции, не растворимой в горячей ТХУК, означает участие меченого субстрата в биосинтезе аминокислот или реакциях биосинтеза клеточных стенок. Природа образующихся газообразных и негазообразных конечных продуктов и их соотношение могут служить ключом к определению типов биоэнергетических путей, используемых в условиях роста, применявшихся в эксперименте. Проводя подобные исследования в изменяющихся условиях роста бактерий (в аэробных и анаэробных, на богатой и бедной среде, в присутствии и в отсутствие различных ингибиторов и т. д.), можно получить дополнительные сведения в этом отношении.

1.3 НАЛИЧИЕ КЛЮЧЕВЫХ ФЕРМЕНТОВ

Другой необходимый этап работы, направленный на выявление какого-либо пути метаболизма, заключается в определении тех ферментов, которые отличают один путь от другого, т. е. являются ключевыми ферментами того или иного пути метаболизма. Разработаны методики определения ключевых ферментов, участвующих во многих классических путях диссимиляции углеводов (табл. 2).

Таблица 2 - Ключевые ферменты путей метаболизма

2 МЕТОДЫ ИСЛЕДОВАНИЯ ПРОНИЦАЕМОСТИ И ТРАНСПОРТА

Хотя детали прохождения растворенных веществ через барьеры проницаемости бактериальных клеток на молекулярном уровне по существу неизвестны, все же можно различать процессы двух основных типов - пассивное проникновение и (активный) транспорт.

Проникновение - это пассивный переход растворенного вещества внутрь клетки (поглощение) или из клетки наружу (выделение) путем диффузии, которому может способствовать химическое взаимодействие между растворенным веществом и какой-либо клеточной структурой, например мембраной. Клетка может быть проницаемой или непроницаемой для данного вещества. Проницаемость - это свойство клетки, а не растворенного вещества.

Транспорт - это процесс активного перемещения растворенного вещества в клетку или из клетки, который связан с метаболизмом и в котором могут участвовать энергизованные переносчики. У бактерий наиболее изучены два класса транспортных систем - фосфотрансферазные и так называемые пермеазные системы. Фосфотрансферазная система встречается главным образом у факультативных анаэробов и предназначена для транспорта сахаров, тогда как пермеазные системы для транспорта аминокислот, сахаров, неорганических ионов и предшественников нуклеиновых кис лот имеются почти у всех бактерий.

Кривая, описывающая ход поглощения растворенного вещества во времени, для процессов транспорта качественно не отличается от аналогичной кривой для пассивного проникновения. Однако активное поглощение не прекращается при С_внутр = С_внешн, продолжается - теперь уже в форме так называемого концентрирующего транспорта - до тех пор, пока будет создан значительный градиент концентрации. Максимальное поглощение определяется соотношением между скоростями процессов, направленных внутрь и наружу.

2.1 ПРОНИЦАЕМОСТЬ БАКТЕРИЙ

2.1.1 Методика измерения

Проникновение растворенного вещества в бактериальные клетки или клеточные структуры чаще всего измеряют с помощью объемного метода или метода концентрированной взвеси. В этом случае используют обычно большие массы клеток - 3 г и больше (влажных клеток) на пробирку. Получение такого количества клеток может представлять проблему, однако не слишком сложную при использовании обычных лабораторных культур. Методы, требующие меньшего количества клеток, основаны на применении мембранных фильтров или мини-центрифуг. В любом случае следует уделять внимание деталям, касающимся выращивания и сбора клеток, так как проницаемость бактерий может сильно изменяться в течение цикла развития периодической культуры или в результате отмывания клеток от компонентов среды. Часто удобнее использовать клетки, полученные в результате непрерывного культивирования. Изменения среды, ее температуры, рН и т. д. тоже могут приводить к изменению проницаемости.

Объемный способ предназначен специально для того, чтобы определять, в какую долю объема (пространства) клеток может проникать изучаемое растворенное вещество. Этот метод основан просто на оценке степени разбавления раствора этого вещества после смешивания его с клетками, осажденными центрифугированием. Необходимы следующие данные:

начальный объем и начальная концентрация изучаемого раствора;

объем осажденных клеток;

конечная концентрация растворенного вещества во внеклеточной фазе смеси осадка и раствора.

Клеточный осадок состоит не только из клеток, но и из межклеточного пространства. Объемную долю межклеточного пространства обычно определяют с помощью растворимых высокомолекулярных полимеров, способных проникать в межклеточное пространство, но не в клетки.

Методика включает следующие этапы.

2.1.1.1 Отмывание клеток

Перед определением проницаемости собранные клетки необходимо отмыть. Однократное промывание большим количеством жидкости обычно позволяет в основном отмыть клетки от компонентов среды, но не удаляет из них в достаточной мере внутренние растворенные вещества. Часто требуется двукратное отмывание, трехкратное же вряд ли оправданно. Клетки многих бактерий, особенно грамположительных, достаточно устойчивы и не подвергаются существенному повреждению при отмывании водой или разбавленными буферными растворами, в особенности охлажденными. Однако многие бактерии - прежде всего грамотрицательные - гораздо чувствительнее, и промывание водой может привести к сильному повреждению клеток. К тому же при отмывании клеток грамотрицательных и некоторых грамположительных бактерий часто наиболее эффективны теплые, а не охлажденные жидкости. Растворы, чаще всего применяемые для отмывания грамотрицательных бактерий, содержат ионы магния (обычно 50 мМ), буфер (например, 50 мМ фосфатный буфер или трис-буфер) и осмотический стабилизатор (например, 0, 4 М NaCl или 0, 5 М сахарозу).

2.1.1.2 Центрифугирование клеток

После отмывания клетки центрифугируют для получения достаточно плотного осадка. Режим центрифугирования зависит от конкретной культуры. При подготовке суспензии для исследования проницаемости клетки нужно центрифугировать значительно дольше того времени, при котором начинается горизонтальный участок кривой, чтобы небольшие отклонения во времени центрифугирования не влияли на вес осадка. Последнее центрифугирование перед добавлением растворенного вещества обычно проводят в тарированной центрифужной пробирке, для того чтобы можно было определить вес осадка.

2.1.1.3 Измерение веса и объема осадка

Вес влажного осадка обычно служит достаточно точным показателем его объема, и в расчетах им можно заменить объем, так как плотность влажных вегетативных бактериальных клеток обычно составляет около 1, 02-1, 04 г/мл. Однако влажные споры бактерий имеют значительно большую плотность (например, 1, 22 г/мл у спор Bacillus stearothermophilus), и вес осадка уже не будет эквивалентен объему. Некоторые включения (например, гранулы поли-b-гидроксибутирата) вегетативных клеток также имеют относительно высокую плотность во влажном состоянии, что может значительно увеличить разницу между весом и объемом осадка. (Определение объёма осадка - см. ПРИЛОЖЕНИЕ).

2.1.1.4 Смешивание клеток с раствором и инкубирование

Клеточный осадок, используемый для определения проницаемости, доводят до нужной температуры и смешивают с раствором изучаемого вещества при помощи стеклянной или покрытой тефлоном палочки, не адсорбирующей жидкость: объем раствора должен быть примерно равен объему осадка. Желательно получить достаточное разбавление, чтобы можно было легко определить разницу концентраций. После перемешивания осадка и раствора суспензию инкубируют в течение известного времени при температуре эксперимента, чтобы могло установиться диффузионное равновесие, - обычно от 15 мин до 1 ч. Лучше всего убедиться, что равновесие действительно устанавливается в течение принятого времени инкубации; для этого проводят опыты с различными осадками и разными периодами инкубации.

2.1.1.5 Повторное центрифугирование

После инкубации каждую смесь осадка с испытуемым раствором центрифугируют в течение достаточного времени, чтобы получить для анализа надосадочную жидкость без клеток. Может потребоваться ее дополнительное центрифугирование для осветления.

2.1.1.6 Определение концентраций растворенного вещества

Концентрации растворенного вещества следует определять и в исходном растворе, который смешивают с клеточным осадком, и в конечном, полученном после повторного центрифугирования. Обычно для этого можно брать небольшие пробы и использовать гравиметрический или рефрактометрический метод. Однако эти методы неспецифичны, и поэтому примесь других веществ, специально добавляемых к суспензии или переходящих в нее из клеток, может создать помехи. В этом случае применяют более специфические химические или радиоизотопные методы.

2.1.2 ОПРЕДЕЛЕНИЕ МЕЖКЛЕТОЧНОГО ПРОСТРАНСТВА

Для того чтобы вычислить объем клеток, доступных для проникновения испытуемого вещества, нужно узнать объем межклеточного пространства в осадке. Соответственно один осадок из каждой опытной серии следует смешать с раствором высокомолекулярного полимера, все молекулы которого слишком велики, чтобы пройти через клеточные стенки, и попадают лишь в межклеточное пространство. Лучше всего для этой цели подходит препарат декстрана со средней мол. массой 2000000 (Dextran T2000). Декстраны полидисперсны, но да же наименьшие молекулы столь высокомолекулярного препарата не проходят через клеточные стенки бактерий.

Вместо декстранов можно использовать некоторые другие полимерные молекулы. Белки (например, сывороточный альбумин) имеют то преимущество, что они в основном монодисперсны и поддаются специфическому анализу. Недостаток же их в том, что они могут связываться с клетками, и это приводило бы к получению завышенных величин поглощения. Использовали также инсулин, но он способен проникать через клеточные стенки многих бактерий, особенно грамположительных.

2.2. ТРАНСПОРТ ВЕЩЕСТВ В КЛЕТКИ БАКТЕРИЙ

2.2.1 Методика анализа

2.2.1.1 Подготовка клеток

Для изучения скоростей транспорта растворенных веществ нужно иметь возможность быстро отделять клетки от среды, в которой они суспендированы. Обычно это делают путем фильтрации через мембранные фильтры, поэтому лучше использовать разбавленные суспензии. Для фильтрации проб объемом 1 мл через фильтр диаметром 25 мм обычно приходится готовить клеточную суспензию, содержащую менее 200 мкг сухого вещества в 1 мл.

2.2.1.2 Смешивание клеток с раствором и инкубирование

Клеточную суспензию и раствор испытуемого вещества доводят отдельно до температуры, выбранной для эксперимента, а затем смешивают, отмечая этот момент как нулевое время. Обычно смешивать надо быстро, так как большинство транспортных процессов протекает с высокой скоростью. Реакционную смесь инкубируют, как правило, недолго (например, 10 мин).

2.2.1.3 Отбор проб и разделение

Пробы реакционной смеси отбирают через короткие интервалы времени (например, 1 мин). Клетки и испытуемый раствор быстро разделяют, обычно путем фильтрации через мембранный фильтр с диаметром пор 0, 45 мкм, предварительно смоченный промывным или испытуемым раствором. Можно использовать фильтры и с меньшим размером пор, но они оказывают большее сопротивление потоку жидкости и замедляют процесс фильтрации. Фильтры с размером пор 0, 45 мкм пригодны для отделения большинства микробных клеток. Обычно используют ацетатцеллюлозные и нитратцеллюлозные фильтры, особенно если планируется сцинтилляционный счет радиоактивности. В некоторых случаях можно отделять клетки центрифугированием, даже если требуются кинетические данные. Такая процедура дает хорошие результаты чаще с грамположительными, чем с грамотрицательными бактериями.

В некоторых случаях нет необходимости отделять клетки от раствора. Например, ионселективные электроды позволяют вести непрерывное наблюдение за рН, парциальным давлением кислорода (рО₂), содержанием ионов калия и т. п. Более того, при изучении поглощения солей часто достаточно бывает лишь следить за изменением проводимости суспендирующей среды с помощью обычной кондуктометрической ячейки.

2.2.1.4 Отмывка клеток

Клетки, остающиеся на фильтре, обычно необходимо промыть для удаления компонентов среды с их поверхности. Промывная жидкость должна быть осмотически забуференной, особенно для грамотрицательных бактерий, так как транспортные системы чувствительны к осмотическому давлению. Для промывания часто используются концентрированные растворы сахаров (например, 0, 5 М раствор сахарозы). Можно также добавлять ионы марганца (обычно 50 мМ) в виде хлорида или сульфата. Идеальный промывной раствор должен в основном удалять исследуемое вещество из осадка клеток и фильтра при первом же промывании. Однако обычно приходится идти на определенный компромисс.

Иногда можно избежать необходимости промывания клеток, центрифугируя их через слой жидких силиконов. Клетки проходят через силикон и образуют осадок, не содержащий меж клеточной воды. Немного воды может остаться на поверхности клеток, и вода клеточных стенок также не удаляется.

2.2.1.5. Удаление клеток и их анализ на содержание исследуемого вещества

Клетки можно элюировать с фильтра, ресуспендировать до известного объема и определять содержание в них изучаемого вещества химическим или радиометрическим способом.

При использовании радиоактивных растворенных веществ чаще всего фильтры высушивают и помещают прямо в сцинтилляционную жидкость для счета импульсов. Можно также определить количество растворенного вещества, включенного в основные биополимеры, обработав клетки на фильтре охлажденным раствором ТХУК и промыв затем водой перед высушиванием. Удобно пользоваться фильтрами, растворяющимися в сцинтилляционной жидкости или в растворителе, смешивающемся с этой жидкостью. Подробно об этом можно прочитать в проспектах фирм или статьях по сцинтилляционному счету.

2.2.2. Общие замечания

Главное преимущество использования разбавленных клеточных суспензий — легкость получения данных по кинетике. Кроме того, в таких суспензиях легче контролировать рО₂, рН, ионную силу и т. п., а также поддерживать почти постоянную концентрацию растворенного вещества в суспендирующей среде. Однако этот подход не лишен недостатков. К ним относятся трудности, связанные с выходом растворенного вещества из клеток во время первичного суспендирования или промывания; необходимость определить поглощение или потери растворенного вещества путем измерения его внутриклеточной, а не внеклеточной концентрации; и наконец, то, что в разбавленных суспензиях клетки могут быть весьма чувствительны к изменениям условий среды.

2.3. СПЕЦИАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ РЕГУЛЯЦИИ МЕТАБОЛИЗМА

2.3.1. Определение протонодвижущей силы

Протонодвижущую силу считают одним из основных средств преобразования и переноса энергии в биологических системах. Ее определяют по формуле:

где D р - протонодвижущая сила, D_y - мембранный потенциал, R - газовая постоянная, Т - температура по Кельвину, F- число Фарадея и DрН - разность рН внутри и вне клетки. При температуре около 25°С величина 2, 3 RT/F (часто обозначаемая z) составляет ~59 мВ. Таким образом, для определения Dр необходимо независимо определить D_y и DрН.

Методы определения D_y обычно включают в себя оценку распределения какого-либо иона, который свободно проходит через клеточную мембрану. Например, можно использовать для вычисления D_y распределение хлорид-иона. Величина D_y в этом случае равна:

2, 3RT/F[log(С1_ввешн)/(С1_внутр)],

где (С1_внешн) и (С1_внутр) - концентрации хлорид-иона вне и внутри клетки.

В последние годы разработаны методики определения внутриклеточного рН у бактерий с помощью ядерного магнитного резонанса. Можно также определять рН_i, используя флуоресцентные красители, такие, как пирамин. Зная рН_i, легко определить рН₀ с помощью стеклянного электрода и затем вычислить ∆ рН.

2.3.2 Осмотически чувствительные клетки

Поглощение клеткой растворенного вещества приводит к снижению активности воды внутри клетки и по следующему притоку воды извне, в результате чего клетка набухает. Биологические мембраны хорошо пропускают воду, и набухание происходит чрезвычайно быстро. Например, методом остановленной струи установлено, что осмотический выход воды из клеток Е. coli, помещенных в 0, 4 М раствор MgCl₂, завершается при 37°С за 50 мс.

2.3.3 Применение неметаболизируемых аналогов субстратов для раздельного изучения транспорта и метаболизма у бактерий

Во многих случаях при изучении транспорта желательно отделить собственно транспортный процесс от последующего метаболизма, особенно в тех случаях, когда нужно продемонстрировать концентрирующее поглощение. В отношении фосфотрансферазных систем полная диссоциация двух процессов невозможна. Существуют три основных способа отделения транспорта от метаболизма:

1) с помощью неметаболизируемых, но транспортируемых аналогов;

2) путем использования мутантов с блокированным метаболизмом, но сохраненным транспортом;

3) с помощью мембранных везикул, не содержащих цитоплазматических ферментов.

Список некоторых часто используемых аналогов приведен в табл.3.

Таблица 3 – Примеры неметаболизируемых аналогов, используемых для изучения транспорта у бактерий

2.3.4 Применение мутантов бактерий с блокированным метаболизмом

Мутанты Salmonella typhimurium применялись для изучения транспорта гистидина у этих бактерий. Широко используются для исследования транспортных процессов мутанты zy⁺ E. соli, лишенные β -галактозидазы, но сохраняющие систему транспорта для β -галактозидов. Мутантные штаммы хранятся в коллекциях генетически маркированных культур.

2.3.5 Мембранные везикулы

Первый этап получения мембранных везикул при изучении транспорта обычно состоит в превращении изучаемых бактерий в осмотически чувствительные формы; последние подвергают лизису в условиях, при которых возможно образование везикул. Сферопласты грамотрицательных бактерий, например Е. соli, можно получить, обрабатывая клетки лизоцимом и ЭДТА; при такой обработке внешняя мембрана клеточной стенки остается на сферопласте. Протопласты грамположительных бактерий часто можно полностью освободить от структур клеточной стенки путем обработки клеток муралитическим ферментом. Для Bacillus теgaterium, Bacillus subtilis, Streptococcus faecalis и М. lysodeikticus использовали лизоцим, для Staphylococcus aureus - лизостафин.

Возможны различные варианты методик выделения везикул, и для выбора оптимальной процедуры применительно к конкретному организму нужны предварительные опыты.

Непрерывность мембраны везикул лучше всего можно проверить, определив степень набухания или сжатия последних при изменении осмоляльности суспендирующей среды. Для этого можно использовать различные методы, включая определение изменений светорассеяния. Функциональное состояние везикул испытывают, определяя их способность к транспорту растворенных веществ, например пролина.

3. РЕШЕНИЕ РАСЧЁТНЫХ ЗАДАЧ

Расчётные задачи выбираются и решаются из числа приведённых в ПРИЛОЖЕНИИ 1.

ПРИЛОЖЕНИЕ 1

ПРИМЕРЫ РАСЧЁТНЫХ ЗАДАЧ

РАСЧЁТ АМИНОКИСЛОТНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ПЕПТИДОВ ПРИ ТРАНСЛЯЦИИ мРНК.

Задача. Предскажите аминокислотную последовательность пептидов, синтезируемых в рибосомах в присутствии следующих матриц, считая, что считывание начинается с первого триплета на левом конце.

а) GGUCAGUCGCUCCUGAUU

б) UUGGAUGCGCCAUAAUUUGCU

в) CAUGAUGCCUGUUGCUAC

г) AUGGACGAA

Решение. a) Gly—Gin—Ser—Leu—Leu—He;

б) Leu—Asp—Ala—Pro;

в) His—Asp— Ala—Cys—Cys—Tyr;

г) Met—Asp—Glu у эукариот;

fMet—Asp—Glu у прокариот.

РАСЧЁТ ЧИСЛА РАЗНЫХ мРНК, КОТОРЫЕ МОГУТ КОДИРОВАТЬ ОДИН ПОЛИПЕПТИД

Задача. Сколько разных мРНК может кодировать одну аминокислотную последовательность?. В качестве дополнительной иллюстрации к рассмотренному в предыдущей задаче вопросу напишите все возможные последовательности мРНК, которые способны кодировать простой трипептид Leu-Met-Туr.

Решение. UUAAUGUAU, UUGAUGUAU, CUUAUGUAU, CUCAUGUAU, CUAAU-GUAU, CUGAUGUAU, UUAAUGUAC, UUGAUGUAC, CUUAUGUAC, CUCAU-GUAC, CUAAUGUAC, CUGAUGUAC.

РАСЧЁТ РЕЗУЛЬТАТОВ ТРАНСКРИБИРОВАНИЯ ЦЕПИ ДНК

Задача. Транскрибируемая цепь двухцепочечной ДНК содержит последовательность

(5') CTTAACACCCCTGACTTCGCGCCGTCG

а) Какая последовательность мРНК может транскрибироваться с этой цепи?

б) Какая аминокислотная последовательность могла бы кодироваться этой последовательностью при считывании с 5'-конца?

в) Предположим, что другая цепь этой ДНК тоже транскрибируется, а полученная мРНК транслируется. Совпадает ли полученная аминокислотная последовательность с последовательностью, которую вы привели в ответе на вопрос б)? Объясните биологическое значение ваших ответов на вопросы б) и в).

Решение. а) (5') CGACGGCGCGAAGUCAGGG-GUGUUAAG (3').

б) Arg—Arg—Arg—Glu—Val—Arg— Gly—Vab-Lys.

в) Нет, так как комплементарные антипараллельные цепи в двухцепочечной ДНК имеют разные последовательности оснований в направлении 5'®3'. РНК транскрибируется только с одной определенной цепи двухцепочечной ДНК. Поэтому РНК-полимераза должна узнавать нужную цепь и связываться с ней.

РАСЧЁТ СОСТАВА АНТИКОДОНОВ, ИСХОДЯ ИЗ КОДОНОВ

Задача. Большинству аминокислот соответствует больше чем один кодон, больше чем одна тРНК и больше чем один антикодон. Напишите все возможные антикодоны для четырех глициновых кодовое:

(5') GGU (3'), GGC, GGA и GGG.

а) На основании вашего ответа скажите, какие из положений антикодона определяют в первую очередь его специфичность в случае глицина?

б) Какие из кодон - антикодоновых пар содержат «качающуюся» пару оснований?

в) В какой из кодон - антикодоновых пар все три пары оснований образованы за счет прочных уотсон - криковских водородных связей?

г) Использование какой из кодон - антикодоновых пар в биологическом синтезе белка наименее вероятно? Почему?

Решение. Глициновые Узнаются антикодонами

кодоны

(5')GGU (5')ACC и (5')GCC

GGC GCC ICC

GGA UCC ICC

GGG CCC UCC

а) На 5'-конце и в середине антикодона.

б) «Качающиеся» пары оснований будут образовывать со своими кодонами анти-кодоны (5')GCC, ICC и UCC.

в) В парах, в образовании которых принимают участие антикодоны (5')ACG, GCC, UCC и CCC.

г) Наименее вероятно использование пар, в которых участвуют антикодоны, указанные в п.

в), поскольку тРНК, содержащие эти антикодоны, из-за прочного связывания всех трех антикодоно-вых оснований будут освобождаться из комплекса с более низкой скоростью, чем другие тРНК для Gly.

РАСЧЁТ ВЕСА И ОБЪЁМА ОСАДКА ПОСЛЕ ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЯ

Объем осадка бактериальных клеток можно легко определить с помощью стандартного пикнометра или мерной колбы. Пусть, например, нужно измерить объем клеточного осадка весом около 3 г. Тогда осадок можно смешать с водой и перенести в 50 мл тарированный пикнометрический сосуд или мерную колбу, а затем довести до нужного объема водой. Допустим, что вес суспензии, определенный с по мощью аналитических весов, равен 50, 110 г (вес смеси и пикнометра минус вес пикнометра), а откалиброванный объем пикнометра равен точно 50, 000 мл при 25°С (температура взвешивания). Предположим также, что вес осадка, найденный с помощью аналитических весов, составляет ровно 3, 000 г. Тогда вес воды, добавленной к осадку, должен быть равен (50, 110-3, 000) г, т. е. 47, 110 г. При 25°С такой вес воды занял бы объем 47, 249 мл, что можно определить по плотности воды при этой температуре, указанной в стандартных химических справочниках. Следовательно, объем осадка равен 50, 000-47, 249, или 2, 751 мл. Тогда плотность составит 3, 000 г/2, 751 мл, или 1, 090 г/мл. При известной плотности и стандартных условиях центрифугирования можно легко вычислить объем осадка по его весу.

РАСЧЁТ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ПРОНИЦАЕМОСТИ КЛЕТОК

Наиболее распространенный, по крайней мере в бактериологии, показатель проницаемости - это величина занимаемого пространства S, которую можно вычислить по формуле:

где V_s - объем раствора, добавленного к осадку, У_р - объем осадка (часто вместо этой величины используют W_p - вес влажного осадка), С₀ - начальная концентрация растворенного вещества и C_f - его конечная концентрация.

Значения S отражают долю объема клеточного осадка, в которую проникает растворенное вещество.

Однако нас интересует доля действительного объема самих клеток, а не осадка, т. е. значение R. Его вычисляют по формуле:

R = (S_sol - S_dex)/(1 - S_dex)

где S_sol - объем, занимаемый исследуемым растворенным веществом, a S_dex - объем «декстранового», или межклеточного, пространства.

Нулевая величина R означает, что клетки непроницаемы для растворенного вещества. Величины R от 0 до 1 означают различную степень проницаемости. R> 1 означает, что растворенное вещество концентрируется в клетках.

При использовании веса осадка как меры его объема обозначения S и R часто сопровождают индексом w. Кроме того, часто желательно бывает отнести полученный результат к единице веса клеток или объема клеточной воды, например указать клеточный объем, проницаемый для сахарозы, на 1 г сухого веса клеток или на 1 мл клеточной воды.

Определение объема клеток. Из найденных значений занимаемого объема (S) можно извлечь полезную цитологическую информацию, например получить наиболее точные данные о средней величине клеток той или иной бактерии. Разность между объемом осадка и межклеточным объемом равна объему клеток. Если осадок ресуспендировать в воде до определенного объема (скажем, 50 мл) в мерной колбе, то можно определить число клеток с помощью камеры Петрова-Хауссера, а затем вычислить средний объем клетки. Этот метод можно также использовать для определения объема протопласта в клетке.