У микроорганизмов 2 страница

Энергетический заряд = (АТР + 1/2ADP)/(ATP + ADP + AMP).

Для измерения ответа фермента на изменения энергетического заряда готовят реакционную смесь с постоянным суммарным содержанием аденилатов (АТР + ADP + AMP) при нужных значениях энергетического заряда. Величина этого пула у различных видов клеток обычно варьирует от 2 до 5 мМ. Для получения трехкомпонентной смеси с заданной величиной энергетического заряда к смеси АМР - АТР добавляют молярную фракцию АТР, соответствующую необходимой величине энергетического заряда, а также аденилаткиназу и инкубируют достаточно долго для установления равновесия Используют различные концентрации Mg²+ и субстрата(ов). Присутствие субстрата в различных концентрациях необходимо потому, что наиболее распространенным ответом ферментов на изменение энергетического заряда является, по-видимому, изменение сродства к одному или нескольким субстратам.

Начальную скорость реакции при каждой концентрации субстрата можно отложить на графике в виде функции энергетического заряда. Совокупность таких АТР кривых для каждой концентрации субстрата отражает влияние энергетического заряда на изучаемый фермент.

1.2 МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ РЕГУЛЯЦИИ МЕТАБОЛИЗМА МИКРООРГАНИЗМОВС ПОМОЩЬЮ КОВАЛЕНТНОЙ МОДИФИКАЦИИ ФЕРМЕНТОВ

1.2.1 Аденилирование

Глутаминсинтетаза занимает центральное место в метаболизме азота у Е. coli и других бактерий. Это проявляется в том, что и синтез, и каталитическая активность этого фермента контролируются множеством процессов. Его синтез регулируется с помощью репрессии/дерепрессии, а активность - рядом конечных продуктов через сложный путь различных эффекторов, а также с по мощью ковалентной модификации. В этой модификации участвует сложная система активирующих и инактивирующих ферментов, а также различные эффекторы. Инактивацию глутаминсинтетазы путем аденилирования можно продемонстрировать in vitro и in vivo. Последний вариант осуществили в условиях аммиачного «шока» следующим образом.

Дикий штамм Е. coli вырастили в минеральной среде с добавлением 0, 4% глюкозы в качестве источника углерода и 0, 2% L-глутамина в качестве источника азота до середины фазы экспоненциального роста. Отобрали пробу для анализа, а оставшуюся культуру разделили на две части. Одну часть оставили необработанной, а ко второй добавили 15 мМ. (конечная концентрация) (NH₄)₂SO₄. Инкубацию продолжали 5-10 мин, затем пробы отобрали для обработки бромидом гексадецилтриметиламмония и анализировали на глутаминсинтетазную активность с помощью глутамилтрансферазного теста с использованием целых клеток. Каждую пробу (10 мл) сразу же вносили в колбу, содержащую бромид гексадецилтриметиламмония с конечной концентрацией 90 мкг/мл, встряхивали 1—3 мин при 30°С и готовили для определения активности фермента. Активность фермента определяли в присутствии и в отсутствие 60 мМ MgCl₂, как указано в методике, для того чтобы установить степень ковалентной модификации в результате аммиачного «шока». Известно, что и у Е. coli, и у К. aerogenes присутствие NH⁴⁺ способствует аденилированию глутаминсинтетазы.

2. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ РЕГУЛЯЦИИ МЕТАБОЛИЗМА МИКРООРГАНИЗМОВ. РЕГУЛЯЦИЯ СИНТЕЗА ФЕРМЕНТОВ

Пригодность микроорганизма для конкретного исследования определяется в основном его генетическими возможностями. Иногда можно изменить генетический потенциал в соответствии с исследовательской задачей. Это делают путем получения и отбора подходящих мутантных штаммов. Отбор таких мутантов - чрезвычайно важная процедура, ставшая одним из основных элементов методического багажа бактериолога.

Даже если генетические возможности микроорганизма позволяют ему продуцировать определенный фермент, при этом еще не гарантируется его синтез (транскрипция и трансляция). Синтез многих ферментов и ферментных систем зависит от присутствия или отсутствия определенных регуляторных компонентов, или «триггеров», образующихся эндогенно или вносимых в культуральную среду. Вещества, стимулирующие транскрипцию, называют индукторами, а сам процесс стимуляции называют индукцией. В тех случаях, когда индукторов нет, говорят о деиндукции. Другие вещества, называемые репрессорами, напротив, предотвращают транскрипцию, а сам процесс предотвращения транскрипции называют репрессией; в отсутствие репрессора происходит дерепрессия. Описаны различные типы репрессии у бактерий: простая репрессия по типу обратной связи, или репрессия конечным продуктом; мультивалентная репрессия, присущая определенным ферментам, участвующим в синтезе аминокислот с разветвленной цепью; координированная репрессия, когда все ферменты, участвующие в биосинтезе, согласованно репрессируются в присутствии высоких концентраций продукта реакции (например, триптофана или гистидина). Описанные ниже эксперименты иллюстрируют некоторые типы регуляции синтеза бактериальных ферментов путем индукции и репрессии.

2.1ИНДУКЦИЯСИНТЕЗА БАКТЕРИАЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ

(НИТРАТРЕДУКТАЗА)

Используя соответствующий дикий штамм Е. coli (например, ML 30 или К-12) и нитрат-редуктазный тест, можно продемонстрировать индукцию нитратредуктазы. Для этого к среде добавляют NО₃^- и выращивают культуру в анаэробных условиях. Можно также измерить накопление и после дующую утилизацию NO₂^- в культуральной среде. Эти два процесса служат индикаторами регуляции активности нитрат-(или нитрит-) редуктазной системы.

Свежую культуру после одной ночи выращивания высевают в несколько колб с основной средой, содержащей (на 1 л): 2 г КН₂РО₄, 7 г К₂НРО₄, 1 г (NH₄)₂S0₄ и 0, 1 г MgSO₄·6H₂O, pH 7, 2. Непосредствен но перед инокуляцией добавляют в нее стерильный раствор, содержащий 0, 02 М глюкозу и 0, 25% (конечная концентрация) безвитаминного гидролизата казеина. Культуру выращивают при сильном встряхивании до по лучения приблизительно 50 мкг клеток (сухого веса) на 1 мл среды или дольше (до видимого помутнения среды) и затем обрабатывают следующим образом.

Культура А: добавляют 20 мМ NaNO₃ и поддерживают в аэробных условиях.

Культура Б: добавляют 20 мМ NaNO₃ и создают анаэробные условия, поместив культуру в плотно закрывающийся сосуд и пропуская через нее N₂ или смесь N₂—CO₂ (95 и 5% соответственно).

Культура В: NaNO₃ не добавляют, но создают анаэробные условия, как описано выше.

Культура Г: добавляют 20 мМ NaNO₃₎ поддерживают в аэробных условиях в течение нескольких часов, затем создают анаэробные условия (как для культуры Б). Если необходимо, культуру вновь переводят в аэробные условия спустя несколько часов.

Подобный эксперимент можно разработать и осуществить при изучении регуляции деградирующей треониндегидратазы. Подобно нитратредуктазе, этот фермент синтезируется только в анаэробных условиях и репрессируется сАМР и катаболитами.

В обоих случаях отбирают пробы культуры (если мутность настолько высока, что мешает последующему анализу, пробы центрифугируют) и определяют образование NO₂^- по следующей методике. Пробы из каждой культуры (0, 2 мл) добавляют к 1 мл реактива А, содержащего 0, 80% сульфаниловой кислоты в 5 н. уксусной кислоте. Пробы разбавляют до 10 мл 0, 05 М фосфатным буфером, рН 7, 5, затем добавляют 1, 0 мл реактива Б (6 мл диметил-α -нафтиламина в 1 л 5 н. уксусной кислоты). Оставляют на 30 мин для развития окраски, измеряют оптическую плотность при 540 нм и вычисляют концентрацию NO₂^- в каждой пробе по ранее полученной калибровочной кривой.

Можно также отбирать пробы культур и после центрифугирования измерять активность нитратредуктазы в клетках. Этот фермент синтезируется только в анаэробных условиях и требует в качестве индуктора NO₃^- (удаление NO₃^- приводит к деиндукции).

2.2 РЕПРЕССИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ КОНЕЧНЫМ ПРОДУКТОМ РЕАКЦИИ (ОРНИТИН - КАРБАМОИЛТРАНСФЕРАЗА)

Этот важный регуляторный процесс легко демонстрируется на большинстве штаммов Е. coli при сравнении культур, выращенных на основной среде, содержа щей глюкозу и минеральные соли, в присутствии L-аргинина и без него [31]. Орнитин - карбамоилтрансфераза катализирует шестую, заключительную, стадию синтеза конечного продукта - L-аргинина. В присутствии L-apгинина синтез фермента репрессируется. Это можно показать при выращивании дикого штамма в течение ночи в любой подходящей солевой среде, содержащей для культуры 1: 0, 02 М раствор глюкозы; для культуры 2: 0, 02 М раствор глюкозы и L-аргинин (100 мкг/мл); для культуры 3: 0, 02 М раствор глюкозы и другую аминокислоту, например гистидин (100 мкг/мл). Клетки собирают, промывают 0, 1 М трис-НС1-буфером, рН 7, 8, и определяют орнитин - карбамоилтрансферазу.

2.3 МУЛЬТИВАЛЕНТНАЯ РЕПРЕССИЯ (L-ТРЕОНИНДЕГИДРАТАЗА)

С помощью подобной же серии опытов можно продемонстрировать чувствительность L-треониндегидратазы (синтезирующего фермента) к мультивалентной репрессии конечным продуктом реакции (L-изолейцином, 1, -лейцином, L-валином). Для такой репрессии требуется присутствие всех трех аминокислот.

Культура 1: 200 мл минимальной среды и 0, 02 М глюкоза.

Культура 2: 200 мл минимальной среды, 0, 02 М глюкоза, 0, 8 мМ L-валин, 0, 4 мМ L-лейцин и 0, 4 мМ L-изолейцин.

Культура 3: 200 мл минимальной среды, 0, 02 М глюкоза, 0, 8 мМ L-валин, 0, 4 мМ L-лейцин и 0, 15 мМ L-изолейцин.

С помощью описанного выше теста на треониндегидратазу измеряют удельную активность фермента в клетках, выращенных в течение ночи в трех описанных выше средах. В культуре 2 должна выявляться более низкая ферментативная активность, чем в культуре 1. Культура 3 будет подвергаться дерепрессии относительно культуры 2 из-за постепенного снижения внутриклеточной концентрации L-изолейцина (содержание L-изолецина в культуре 3 понижено с самого начала, и, кроме того, его поглощение ингибируется двумя другими аминокислотами).

2.4 ИНДУКЦИЯ ПЛЮС РЕПРЕССИЯ (LAC-ОПЕРОН)

При функционировании lac -оперона Е. coli происходит как репрессивная (отрицательная), так и индуктивная (положительная) генетическая регуляция. Присоединение lac -репрессора (продукта гена i) к сайту оператора предотвращает транскрипцию генов, катализируемую РНК-полимеразой (отрицательная регуляция). Индуцирующий агент (любой из β -галактозидов) модифицирует белок-репрессор таким образом, что он теряет способность связываться с оператором. Однако одного этого недостаточно для инициации процесса транскрипции. Чтобы РНК-полимераза смогла осуществлять свою каталитическую функцию в транскрипции, необходимо присутствие положительного регуляторного элемента - белка - рецептора сАМР (продукта сrр- локуса). Такой модифицированный благодаря связыванию сАМР белок присоединяется к промотору. В результате включается lac -оперон и начинается транскрипция. В отсутствие индуктора (деиндукция) или при уменьшении образования сАМР из-за ингибирования аденилатциклазной активности (катаболитная репрессия) транскрипция предотвращается. Аденилатциклаза - это связанный с мембраной фермент, катализирующий превращение АТР в сАМР и пирофосфат. Этот фермент обычно активен во время роста культуры в различных средах, и поэтому клетки образуют сАМР в достаточном количестве. Однако в присутствии некоторых субстратов, например глюкозы или маннита, активность фермента ингибируется и образование сАМР снижается (это явление называют катаболитной репрессией).

3. РЕШЕНИЕ РАСЧЁТНЫХ ЗАДАЧ

Расчётные задачи выбираются и решаются из числа приведённых в ПРИЛОЖЕНИИ 1

ЗАНЯТИЕ 3

АНАЛИЗ ПУТЕЙ МЕТАБОЛИЗМА МИКРООРГАНИЗМОВ. МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ РЕГУЛЯЦИИ ПРОНИЦАЕМОСТИ КЛЕТОК И СКОРОСТИ ТРАНСПОРТНЫХ ПРОЦЕССОВ. РАСЧЁТНЫЕ ЗАДАЧИ.

ВВОДНАЯ ЧАСТЬ

Ферменты существуют не в виде отдельных самостоятельных компонентов, функционирующих независимо и случайно, а в виде ансамблей, отдельные элементы которых взаимосвязаны и выполняют свои функции взаимозависимо в определенной последовательности.

Бактериальную клетку можно в действительности рассматривать как одну большую мультиферментную систему, работе которой присуща определенная гармония. Помня о целостности системы, в практической работе мы, однако, вынуждены иметь дело с отдельными группами реакций, составляющими те или иные пути метаболизма. Путями метаболизма обычно называют последовательность координированных реакций, имеющих биосинтетическое или биоэнергетическое значение, например цепь переносчиков электронов, гликолитический путь или пути биосинтеза аминокислот с разветвленными цепями. Именно изучение таких путей, а не исследование отдельных ферментов способствовало накоплению современных знаний о метаболизме бактерий.

Подробный анализ и оценка имеющихся в настоящее время методик изучения путей метаболизма, регуляции проницаемости клеток и скорости транспортных процессов поможет получить общее представление о методических особенностях данных проблем.

ОСНОВНЫЕ ТЕРМИНЫ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Пути метаболизма - это последовательность координированных реакций, имеющих биосинтетическое или биоэнергетическое значение, например цепь переносчиков электронов, гликолитический путь или пути биосинтеза аминокислот с разветвленными цепями.

Проникновение - это пассивный переход растворенного вещества внутрь клетки (поглощение) или из клетки наружу (выделение) путем диффузии, которому может способствовать химическое взаимодействие между растворенным веществом и какой-либо клеточной структурой, например мембраной.

Проникновение растворенного вещества через клеточную мембрану описывается уравнением:

dS/dt = РА(∆ С)

где dS/dt - изменение количества растворенного вещества внутри клетки в единицу времени, Р - коэффициент проницаемости (с размерностью расстояние/время), А - площадь мембраны и ∆ С - разность концентраций растворенного вещества внутри и вне клетки.

Транспорт - это процесс активного перемещения растворенного вещества в клетку или из клетки, который связан с метаболизмом и в котором могут участвовать энергизованные переносчики.

У бактерий наиболее изучены два класса транспортных систем - фосфотрансферазные и пермеазные системы.

Фосфотрансферазная система встречается главным образом у факультативных анаэробов и предназначена для транспорта сахаров.

Пермеазные системы имеются почти у всех бактерий и предназначены для транспорта аминокислот, сахаров, неорганических ионов и предшественников нуклеиновых кислот.

Обменная диффузия - это обмен внутренних и наружных веществ через клеточную мембрану в соотношении 1: 1.

СОДЕРЖАНИЕ УЧЕБНЫХ ВОПРОСОВ

1 АНАЛИЗ ПУТЕЙ МЕТАБОЛИЗМА

1.1 ОБЩИЕ МЕТОДЫ

1.1.1 Идентификация промежуточных продуктов

В процессе катаболизма некоторых субстратов растущими или покоящимися бактериальными клетками в среде могут накапливаться промежуточные продукты, где их легко идентифицировать различными химическими, хроматографическими или радиоизотопными метода ми. Один или несколько промежуточных продуктов будут накапливаться в том случае, если скорость их синтеза превышает скорость диссимиляции в ходе последующих реакций определенного пути метаболизма. Когда происходит исчерпание исходного субстрата, накопление часто сопровождается потреблением.

Например, культуры Е. coli, растущие на богатой среде с глюкозой в качестве основного источника углерода и энергии, накапливают и затем утилизируют пируват. С помощью такого типа исследований получена существенная информация о путях метаболизма, связанных с разложением ароматических веществ.

1.1.2 Использование ингибиторов метаболизма

В исследованиях путей метаболизма широко используются ингибиторы. При добавлении в культуру ингибитора какого-либо этапа пути метаболизма может происходить накопление одного или нескольких метаболитов, образовавшихся до этого этапа, которые благодаря такому накоплению легко идентифицировать. Получаемую при этом информацию можно использовать для установления последовательности реакций. Например, наши знания о химической природе стенок микробных клеток основаны на том наблюдении, что при обработке клеток Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis или Е. coli такими антибиотиками, как пенициллин, бацитрацин или циклосерин, накапливаются различные нуклеотиды, участвующие в биосинтезе клеточных стенок. Если ингибиторы (метаболические яды) оказываются эффективными в подобных исследованиях, очевидно, клетки должны быть проницаемыми для них. При оценке данных, получаемых с использованием ингибиторов, всегда следует проявлять осторожность, поскольку могут существовать неизвестные этапы ингибирования.

1.1.3 Использование аналогов субстрата

Ферменты определенного пути метаболизма могут различаться по субстратной специфичности. Например, может оказаться, что первые три фермента способны взаимодействовать с аналогом природного субстрата, а четвертый - нет. В этом случае будет накапливаться частично метаболизированный аналог, который несложно идентифицировать, благодаря чему легче определить место соответствующих реакций в цепи метаболизма.

1.1.4 Одновременная адаптация

Метод одновременной адаптации основан на следующем логическом построении. Если индуцибельный диссимиляционный путь (например, А®B®С®D®цикл трикарбоновых кислот) индуцируется необходимым для роста субстратом А, у клеток развивается способность к диссимиляции метаболитов В, С, D, так же как и А, но не других веществ, не являющихся промежуточными продуктами этого пути метаболизма. Если, например, путь включает окисление всех указанных компонентов, можно ожидать окисления (измеряемого с помощью аппарата Варбурга или кислородного электрода) субстратов А, В, С и D, но не Е, F и G, если только клетки не способны конститутивно утилизировать одно или несколько из последних веществ. Такую способность можно определить с помощью теста на их окисление, используя клетки, выращенные не на субстрате А. Не исключено, однако, что субстраты В, С или D, являясь компонентами пути, не могут проникать в клетки и вследствие этого не будут подвергаться окислению. Для определения этой возможности необходимо использовать клеточные экстракты или пермеабилизованные клетки, обработанные с целью повышения проницаемости.

1.1.5 Использование клеточных экстрактов

Большинство описанных выше методик можно осуществить, используя вместо целых клеток клеточные экстракты. Накопление промежуточных продуктов и (или) кофакторов может происходить спонтанно, или его можно инициировать, используя метаболические яды или аналоги субстратов. При использовании клеточных экстрактов трудности, связанные с проникновением веществ в клетки, устраняются, что упрощает анализ, Однако ферменты изучаемого пути метаболизма не находятся при этом в своей естественной среде, и поэтому их активность может изменяться или они вообще могут быстро инактивироваться.

1.1.6 Использование радиоизотопов

Использование радиоизотопов, в частности соединений, содержащих ¹⁴С, ³²Р, ³Н или ³⁵S, чрезвычайно важное средство изучения путей метаболизма. Описание и оценку различных методик, разработанных для этой цели, здесь мы рассмотрим лишь в общих чертах.

Во-первых, следует отметить, что эти методики имеют свои трудности и «подводные камни». Главнейшая из трудностей связана с необходимостью работы с чистыми веществами. «Перед использованием радиоактивной метки необходима тщательная проверка ее чистоты, так как лучше вообще не работать, чем работать с не чистым исходным веществом». Так, длительные попытки проследить путь второй транспортной системы для глюкозо-6-фосфата, были безуспешны только по причине артефакта, возникающего из-за присутствия небольшого количества примеси свободной ¹⁴С-глюкозы во всех препаратах ¹⁴С-глюкозо-6-фосфата, за исключением свежеприготовленных. Эти соединения были использованы в опытах в качестве субстрата.

Даже при использовании чистых веществ, проследить судьбу меченых молекул одного вида среди несметного числа взаимосвязанных и часто обратимых потоков метаболических реакций непросто. Чем быстрее метаболиты входят в активные метаболические пулы, тем труднее выявить их специфические функции. Поскольку активно делящиеся бактерии (в отличие от покоящихся клеток) прежде всего осуществляют реакции синтеза, оборот и перераспределение метаболитов у них сводится к минимуму. Поэтому для радиоизотопного анализа путей метаболизма рекомендуется использовать по возможности активно делящиеся бактерии. Полезно также использование соответствующих мутантных штаммов с дефектом, который снижает до минимума или исключает распределение и (или) оборот метаболитов.

В ряде случаев успешно применяется метод быстрого отбора проб. Он оказался эффективным при изучении пути фиксации ¹⁴СО₂ одноклеточными зелеными водорослями. С его помощью был обнаружен глиоксалатный цикл у Pseudomonas и других организмов. Согласно этому методу, радиоактивную метку добавляют к клеткам на очень короткое время (секунды или минуты), а затем сразу же определяют меченые продукты.

Для анализа путей метаболизма можно также использовать метод конкуренции изотопов. Этот метод основан на том, что при мечении всех компонентов, участвующих в определенном пути метаболизма, добавление немеченого компонента вызывает пропорциональное снижение удельной радиоактивности всех метаболитов начиная с добавленного. Этот метод широко и успешно применили в классических исследованиях биосинтеза аминокислот у Е. coli.

Метод радиореспирометрии относится к классу методов, с помощью которых можно измерять дыхательную активность биологической системы. С его помощью изучают скорость и степень превращения ¹⁴С-субстрата (например, 1-¹⁴С-глюкозы, 3, 4-¹⁴С-глюкозы или DL-1-¹⁴С-глутамата) в СО₂, выделяющийся при дыхании. Этот метод используется для анализа путей катаболического дыхания у дрожжей и различных бактерий, включая среди прочих Brevibacte-rium, Arthrobacter, Xanthomonas, Corynebacterium, Neisseria и Escherichia. Он широко применяется для определения потока углерода через взаимосвязанные пути, такие, как путь Эмбдена - Мейергофа - Парнаса, путь Энтнера - Дудорова, пентозофосфатный путь, путь глюкуроновой кислоты и цикл трикарбоновых кислот.

Как и другие методы исследования, радиореспирометрия имеет определенные недостатки и ограничения. Как правило, он требует изготовления специального оборудования, которого нет в продаже. Его, впрочем, можно изготовить с минимальными затратами, как, например, в случае блока с шестью сосудами (рис. 9). Стеклодув может легко превратить 250 мл колбы Эрленмейера в сосуды для радиореспирометрии, а обычные хроматографические колонки - в устройства для улавливания СО₂. Список необходимого оборудования включает измеритель потока газа, термостатируемую качалку, штатив для укрепления измерителя потока и поглотителя СО₂, и жидкостный сцинтилляционный счетчик. Ограниченность использования этого метода обусловлена тем, что некоторые соединения, специфически меченные ¹⁴С, которые могут потребоваться при проведении определенных работ, отсутствуют в продаже.

1.1.7 Использование индуцированных ауксотрофов

Принципы, лежащие в основе применения ауксотрофных мутантов для изучения различных метаболических путей, в частности путей биосинтеза, хорошо известны, а подробности отбора и использования таких мутантов изложены в лекциях. Рассмотрим последовательность пути биосинтеза:

A B C D E

где Е - конечный продукт, необходимый для роста культуры.

Любая мутация, влияющая на фермент Е₁, Е₂, Е₃ или Е₄, приведет к остановке роста культуры, если только не будет обеспечено поступление соответствующего метаболита из другого источника. Этот мета болит, естественно, должен транспортироваться в клетки. Метаболиты, образующиеся перед поврежденной стадией, при наличии достаточных количеств ростовых субстратов будут накапливаться в высоких концентрациях. Идентификация накапливающихся метаболитов и метаболитов, стимулирующих рост мутантных клеток, наряду с соответствующими исследованиями фермента может дать существенную информацию о последовательности реакций данного пути метаболизма. Такие методики с использованием мутантов с большим успехом применяются при изучении синтеза аминокислот с разветвленной цепью, в том числе ароматических аминокислот.

1.2 БАЛАНС ИЗОТОПНОГО УГЛЕРОДА

1.2.1 Общие замечания

Представьте следующую гипотетическую ситуацию: вы выделяете культуру новой бактерии, о которой не знаете ничего, кроме того, что она растет в комплексной среде неопределенного состава, содержащей глюкозу. Ваша задача - описать в общих чертах пути метаболизма этой бактерии. Как бы вы приступили к решению этой задачи? Прежде всего возникают вопросы: какие биоэнергетические пути использует бактерия; какое количество углерода глюкозы ассимилируется при биосинтезе, если только это вообще имеет место; в какие макромолекулярные компоненты включается углерод? Что бы справиться с поставленной задачей, потребуется ответить на все эти вопросы (как и на многие другие, естественно). Экспериментальное определение радиоизотопного баланса служит серьезным фундаментом, на основе которого можно сделать попытку решить эту задачу. Культуру выращивают в течение времени, достаточного для диссимиляции 30-70% добавляемой глюкозы, меченной ¹⁴С (равномерно или специфически в положениях С-1, С-3, 4 или С-6). В конце выращивания подводят баланс ¹⁴С. Полученные при этом данные служат отправной точкой в определении путей метаболизма.

1.2.2 Определение неиспользованного субстрата

Концентрацию глюкозы в начале и в конце периода роста культуры определяют с помощью любой стандартной методики. Разность этих величин равна количеству глюкозы, потребленной клетками. Поскольку удельная радиоактивность глюкозы известна, можно вычислить процент суммарной активности культуры в минуту, приходящейся на неиспользованную глюкозу. Следовательно, остальная радиоактивность приходится на СО₂, не газообразные конечные продукты и углерод, ассимилированный клетками.

1.2.3 Определение ассимилированного ¹⁴С

Готовят различные разведения вышеуказанной культуры, фильтруют их через мембранные фильтры (с размером пор 0, 45 мкм), промывают и затем измеряют общую радиоактивность, которая соответствует радиоактивному углероду, включенному в клетки.

1.2.4 Определение негазообразных конечных продуктов

Перед окончанием роста культуры отбирают 5 мл пробы (или больше) и добавляют к 5 мл смеси немеченых соединений, содержащей достаточное количество H₂SO4, так чтобы конечный рН был равен 1, 5—1, 8. При этом происходит остановка реакции и перевод всех присутствующих в среде метаболитов в кислотную форму. Смесь немеченых соединений (при использовании Е. coli) содержит следующие компоненты, растворенные в основной ростовой среде: этанол, уксусную кислоту, пировиноградную кислоту, муравьиную кислоту, фумаровую кислоту, молочную кислоту, янтарную кислоту и лимонную кислоту. Ввиду малых количеств конечных продуктов в 5-10 мл культуральной среды использование смеси немеченых соединений существенно для получения количественного выхода радиоактивных конечных продуктов, образуемых клетками. Концентрация каждого компонента смеси равна 0, 1 М, за исключением фумаровой кислоты, концентрация которой составляет 0, 05 М. Смесь немеченых соединений вместе с культурой центрифугируют для удаления клеток. Надосадочную жидкость отделяют и хранят до анализа в замороженном состоянии. При исследовании разных организмов требуется приготовление смесей различных немеченых соединений. Их состав, естественно, зависит от природы конечных продуктов, которые должны накапливаться в культуральной жидкости.

Негазообразные конечные продукты, присутствующие в 1 мл такой пробы, определяют с помощью хроматографии на кремневой кислоте.

1.2.5 Расчет и определение баланса

Подсчитав общую радиоактивность, связанную с каждым из описанных выше этапов, можно представить общую картину и определить некоторые метаболические пути, которые либо используются, либо не используются в данных условиях роста.

В конце периода роста бактерий вся исходная радиоактивность (R_исх) должна быть равна сумме радиоактивностей неиспользованного субстрата (S_H), газообразных конечных продуктов (G), ассимилированного углерода (А) и негазообразных конечных продуктов (Е). Если это не соблюдается, то возможна какая-либо экспериментальная ошибка.