Выделение плазмидной ДНК по протоколу компании евроген

Необходимые материалы

•Микроцентрифужные пробирки (1.5-2 мл) для сбора элюата

•Этиловый спирт (96%)

Подготовка растворов

•Добавьте 31 мл этилового спирта (96%) во флакон с концентриро-

ванным «Промывочным раствором». Рекомендуется нанести помет-

ку о выполнении операции на крышку флакона.

•Добавьте к лиофилизированной РНКазе A небольшой объем

(примерно 1 мл) «Ресуспендирующего раствора». Перенесте

полученный раствор РНКазы A во флакон с «Ресуспендирующим

раствором».

Протокол выделения плазмидной ДНК

Все центрифугирования проводят в настольной центрифуге.

1.Перенесите 1-2 мл бактериальной культуры в 2-х мл микроцент-

рифужные пробирки, осадите клетки центрифугированием в те-

чение 1 минуты (5000-7000g). Полностью удалите супернатант.

Далее все центрифугирования проводят на максимальной ско-

рости (10000-13000g).

2. Добавьте 250 мкл «Ресуспендирующего раствора» к осадку и

тщательно ресуспендируйте.

3.Добавьте 250 мкл «Лизирующего раствора». Осторожно пе-

ремешайте содержимое пробирки, переворачивая пробирку

до тех пор, пока лизат не станет прозрачным. Инкубируйте не

более 1 минуты.

I Не используйте вортекс: быстрое перемешивание приводит к разрыву бактериальной хромосомы и загрязнению препарата плазмиды геномной ДНК.

4. Добавьте 350 мкл «Нейтрализующего раствора», перемешайте

содержимое, переворачивая пробирку до образования творожистой взвеси. Инкубируйте 1 минуту.

I Не используйте вортекс.

5. Центрифугируйте пробирку в течение 10 мин.

6. Поместите спин-колонку в собирательную пробирку. Перенеси-

те осветленный супернатант в микроколонку. Центрифугируйте

колонку 30 секунд.

I В процессе центрифугирования плазмидная ДНК сорбируется на силиконовом носителе колонки.

7. Удалите фильтрат из собирательной пробирки.

8.Опция:

Добавьте 200 мкл «Раствора для удаления эндотоксинов» в колонку. Центрифугируйте колонку 30 сек. Удалите фильтрат из собирательной пробирки.

I Выполнение этой процедуры рекомендуется, если планируется использование плазмидной ДНК для трансфекции или трансформации.

9. Добавьте 300 мкл «Промывочного раствора» в колонку. Центрифугируйте колонку 30 сек. Удалите фильтрат из собирательной пробирки.

10.Повторите стадию 9 протокола.

11. Центрифугируйте пустую колонку 60 сек для полного удаления «Промывочного раствора».

12. Поместите колонку в новую пробирку (1.5–2 мл).

13. Нанесте в центр мембраны 30-50 мкл «Элюирующего раствора».

Инкубируйте пробирку 60 сек при комнатной температуре. Центрифугируйте колонку 30 сек для сбора очищенной ДНК.

Очищенная ДНК пригодна для любых генно-инженерных приложений. Хранить при -20°C.