Спектрофотометрическое определение концентрации ДНК и РНК

Наиболее распространенными методами определения концентрации ДНК\РНК в полученном препарате являются спектрофотометрический метод, а также метод определения концентрации ДНК/РНК с помощью горизонтального электрофореза в агарозном геле (см. раздел «Горизонтальный электрофорез в агарозном геле»). Спектрофотометрическое определение концентрации ДНК/РНК основано на том, что ДНК/РНК имеют максимум поглощения при 260 нм. Эта величина является неким средним между поглощением отдельных нуклеотидов, которое может варьировать между 256 нм и 281 нм. Все измерения проводятся в кварцевых кюветах, пропускающих ультрафиолетовую часть спектра. Пример спектра поглощения раствора ДНК в воде приведен на рисунке ниже.

Концентрации ДНК/РНК рассчитывают исходя из того, что раствор ДНК с концентрацией 50 мкг/мл и раствор РНК с концентрацией 40 мкг/мл имеет OD260, равное 1 (при стандартном оптическом пути 10мм). Если препарат ДНК/РНК перед измерением был разведен, необходимо также учитывать разведение. Таким образом, концентрации ДНК/РНК в препаратах рассчитывают по следующим формулам:

[C _DNA] = 50 х OD260 х разведение

[C _RNA] = 40 х OD260 х разведение

Спектрофотометрический метод также позволяет определить чистоту полученного препарата ДНК/РНК и выявить наличие в препарате других веществ. Для этого необходимо дополнительно провести измерения оптической плотности при 230 нм (примесь полисахаридов), 280 нм (примесь белков) и 320 нм (наличие крупных частиц, которые могли попасть в препарат при выделении). Препараты ДНК и РНК считаются «чистыми», если соотношение OD260/OD280 £ 1.9 и 2.0, соответственно, а OD320 равно 0 или пренебрежимо мало. Также настоятельно рекомендуется по возможности проводить запись спектра поглощения анализируемого препарата в диапазоне длин волн от 200 нм до 320 нм (особенно это актуально в случае низких концентраций ДНК/РНК в препарате).

Рис.2. Спектр поглощения раствора ДНК в воде.

Следует обращать внимание на те компоненты раствора, которые могут поглощать при этих длинах волн, например детергенты, ЭДТА, остатки фенола, т.к. это также может оказывать влияние на конечный результат.