Выделение РНК из эукариотических клеток и тканей

В качестве источника эукариотической РНК могут быть использованы эмбрионы, кусочки тканей, клетки эукариот или биологические жидкости. Обычно проводят выделение либо тотальной клеточной РНК (тотРНК), либо матричной РНК (мРНК). Полученный препарат РНК затем используют для таких генно-инженерных задач, как синтез обратной цепи кДНК (обратная транскрипция), амплификация необходимых генов методом обратной транскрипции, совмещенной с ПЦР-реакцией (ОТ-ПЦР), создание скрининговых библиотек, in vitro трансляция, а также Nothern-blot гибридизация.

В состав тотальной РНК эукариот входят сразу несколько видов РНК: две рибосомальные РНК с различным коэффициентом седиментации, малые ядерные РНК, митохондриальная РНК, транспортная РНК и матричная РНК. При успешном выделении тотальной РНК все ее составляющие можно визуализировать методом РНК-электрофореза. Эукариотическая матричная РНК представлена набором фрагментов (0.5 kb – 20 kb) разного размера и составляет 1 – 5 % от общей тотальной РНK.

Качество выделенной тотальной РНК можно проверить с помощью формальдегидного электрофореза. Доказательством целостности РНК служит несколько признаков (см. рис.1): 1) Интенсивность полосы 28S примерно в 2 раза выше, чем интенсивность 18S

2) Полоса 5S+5, 8S окрашена слабо

3) Отсутствуют дополнительные полосы и не вошедший в лунки материал.

Рис.1. Анализ препарата тотальной РНК методом формальдегидного электрофореза.

С некоторым приближением можно оценивать качество РНК простым электрофорезом в агарозе. Камера для электрофореза и реактивы должны быть соответствующим образом обработаны (см. ниже).

Среди методов выделения тотальной РНК наиболее популярными являются гуанидин-тиоционатный метод (ГТЦ-метод) и горячий кислый фенольный метод. ГТЦ-метод используют в основном для выделения тотальной РНК из клеток и тканей эукариот. Для этого ткань измельчают и обрабатывают гуанидин-тиоционат содержащим буфером. Гуанидин-тиоционат облегчает механическое разрушение ткани и одновременно выполняет функцию ингибирования РНКаз. Экстракт ткани в гуанидинтиоционатном буфере затем фракционируют с помощью смеси фенол\хлороформ при кислых значениях pH. Это приводит к появлению трех фаз: водной, органической и интерфазы. В водной фазе содержится РНК, в органической ДНК, а интерфаза представлена белками. Переход ДНК в органическую фазу происходит под действием фенола в кислой среде. Водную фазу собирают и проводят осаждение РНК с помощью этанола.

В отличие от двуцепочечной, стабилизированной водородными связями молекулы ДНК, одноцепочечная РНК легко подвергается деградации под действием РНКаз, поэтому ее выделение следует выполнять с особой аккуратностью. Для этого необходимо работать только с предварительно стерилизованной посудой, носиками и эппендорфами, все операции проводить в перчатках и часто их менять, а для растворения РНК использовать только предварительно проавтоклавированную воду с добавлением ингибиторов РНКаз. Если протокол выделения РНК подразумевает использование водных растворов, их так же следует обработать ингибиторами РНКаз. Эффективными неспецифичными ингибиторами РНКаз является DEPC (диэтилполикарбонат), а также β -меркаптоэтанол, дитиотреитол и другие тиол-содержащие соединения. DEPC обычно использую в концентрации 0.1%, а тиолсодержащие соединения – в концентрации 0.03 % (β -меркаптоэтанол). Следует отметить, что растворы, содержащие Трис, нельзя обрабатывать с помощью DEPC! Свободные аминогруппы инактивируют DEPC и делают процедуру как минимум бесполезной. Необходимо помнить, что DEPC даже в следовых количествах способен инактивировать фременты, что особенно при работе с ДНК/РНК полимеразами, рестриктазами и ДНК-модифицирующими ферментами. DEPC инактивируют автоклавированием, после чего растворы считаются свободными от его следов.