Механизмы развития апоптоза и методы его выявления

В развитии апоптоза можно выделить три фазы. Суть первой из них — рецепция сигнала и начальные этапы его передачи; эта фаза обратима. Вторая фаза — активация каспаз — является ключевым событием в развитии апоптоза; она приводит к необратимым последствиям. Третья фаза состоит в реализации гибели клетки, запрограммированной на предыдущем этапе. Проявления первой фазы развития апоптоза многообразны. Вторая и третья фазы протекают более стандартно. По современным представлениям пути и механизмы запуска апоптоза сводятся к двум механизмам — рецепторному и митохондриальному, которые схематически отображены на рисунке 51.

Наиболее детально изучен рецепторный механизм включения апоптоза [121]. На поверхности клеток могут экспрессироваться специализированные Рц, передающие сигналы к развитию апоптоза. Их общее обозначение –Рц «смерти» (death receptors — DR). Эти Рц относятся к семейству Рц фактора некроза опухоли (TNF). От других Рц этой группы они отличаются наличием в цитоплазматической части специального домена «смерти» (death domain — DD), необходимого для включения внутриклеточного сигнала, приводящего к развитию апоптоза. К настоящему времени описано 6 DR–Рц. Среди них наиболее известен Fas–Рц (АРО–1, CD95). Его лигандом служит тримерная молекула, относящаяся к семейству TNF — Fas–лиганд (FasL, CD178) [337]. Известны мембранная и растворимая формы FasL, из которых первая является значительно более эффективным индуктором апоптоза клеток фенотипа CD95, чем вторая. К DR-семейству относится такжеTNF–R1 — Рц TNF 1–го типа (p55, CD120A), тогда как Рц 2–го типа (р75, CD120B) лишен домена «смерти» и непосредственно не включает апоптогенные сигналы [582]. Лигандом для TNF–R1 служат молекулы семейства TNF — TNFa и лимфотоксин a (TNFb). Рц DR3 передает сигналы от недостаточно охарактеризованной молекулы DR3L (APO3-L). DR4 и DR5 служат Рц для молекулы TRAIL. Этот тример, также относящийся к семейству TNF, связывается, кроме того, с Рц-ловушками DcR1 и DcR2, обусловливающими разрушение TRAIL. В связи с этим TRAIL не играет существенной роли в индукции апоптоза нормальных клеток, однако он индуцирует апоптоз опухолевых клеток, на которых Рц-ловушки отсутствуют или экспрессируются слабо [584]. Природа лиганда DR6 пока не установлена.

Во всех случаях взаимодействие тримерных лигандов с Рц приводит к тримеризации последних, что является обязательным условием их функционирования в качестве передатчиков апоптотических сигналов. При этом домены смерти приобретают способность взаимодействовать с аналогичными доменами адаптерных белков FADD (Fas–associated death domain) и TRADD(TNF–receptor death domain). FADD узнает домены смерти в составе прокаспазы 8 и, взаимодействуя с ними, обусловливает активацию каспазы 8. Результат действия TRADD аналогичен, но он реализуется через посредство FADD. Формирующиеся в результате указанных взаимодействий молекулярные комплексы называют DISC (Death–inducing signaling complex). Рецепторный путь включения апоптоза не требует синтеза РНК и белка de novo. Поскольку апоптоз при этом запускается путём активного воздействия на клеточные Рц, он обозначается как активный апоптоз.

Другая группа механизмов включения апоптоза реализуется в условиях дефицита ростовых факторов, когда клетка как бы предоставляется сама себе (апоптоз «по умолчанию» — рис. 51) [586]. Данную форму апоптоза называют ещё пассивным апоптозом. Механизм пассивного апоптоза используется при гибели клеток под действием стрессорных факторов (в том числе облучения), глюкокортикоидов и ряда токсических агентов, например цитостатиков, применяемых в онкологической практике. В этих случаях основой апоптоза служат процессы, запускаемые в митохондриях и сводящиеся к повышению проницаемости их мембраны для проапоптотических факторов.

Рис. 51. Развитие апоптоза: показаны два механизма включения апоптоза — обусловленный повышением проницаемости митохондрий (апоптоз «по умолчанию») и рецепторный («активационный»). Оба механизма приводят к реализации апоптоза по единому зффекторному механизму. TRAIL — лиганд, индуцирующий связанный с фактором некроза опухоли апоптоз; FasL — лиганд для РцFas (от Fas ligand); TNFRI — Рц для фактора некроза опухоли I (от TNF receptor I); DR — Рц «смерти» (от — Death receptor); FADD — домен «смерти» Рц Fas (от Fas–associated death domain); TRADD — домен «смерти» Рц для фактора некроза опухоли (от TNF–receptor associated death domain). Около значков, символизирующих факторы, указано их название. Сплошные стрелки означают превращения, пунктирные — влияния, штриховые — перемещения факторов. Пояснения в тексте.

Многие клетки (возможно большинство из них) нуждаются в специальных сигналах для поддержания своей жизнеспособности. Источником таких сигналов выживания обычно служат цитокины и контактные взаимодействия с окружающими клетками. В отсутствие сигналов выживания в клетке нарушается функция митохондрий, в частности механизмы гликолиза и дефосфорилирования АТФ. Поскольку АДФ и продукт гликолиза пируват необходимы для нормального осуществления окислительного фосфорилирования, транспорта электронов и создания градиента протонов, эти процессы нарушаются, что приводит к повреждению мембраны митохондрий [474].

Параллельно срабатывает механизм, который реализуется белками — продуктами протоонкогенов семейства Вс1–2 [462]. Эти белки делятся на несколько групп. Часть белков содержат 3–4 ВН–домена (ВН — от Bcl–2 homology) и разделяется на анти–апоптотические (Bcl–2, Bcl–X_L, Mcl–1 и т.д.) и про-апоптотические (Вах, Bak, Bcl–X_S и т.д.) факторы. Особую группу составляют «только-ВН3»-белки («ВН3-only» — Bad, Bid, Bik, Bim, Noxa, Вbс3 и т.д.), которые, в соответствии с названием содержат только один ВН–домен — ВН3, а в остальном отличаются от белков рассматриваемого семейства. Именно «только-ВН3»-белкам, прежде всего Bim, мобилизуемому из цитоскелета, отводят роль пусковых факторов апоптоза по умолчанию [284, 385]. Экспрессия или активация «только-ВН3»-белков происходит в условиях дефицита цитокинов и других факторов выживания, а также при активации белка p53, являющегося сенсором разрывов ДНК (в последнем случае активируются «только-ВН3»–факторы Noxa и Вbс3) [601]. «Только-ВН3»-белки блокируют анти–апоптотические факторы типа Bcl–2, образуя с ними димеры, и способствуют проявлению активности проапоптотических факторов. Ключевым проявлением активности последних является формирование трансмембранных пор, которые образуются в результате олигомеризации Вах и Вак, в норме подавляемой антиапоптотическими факторами.

Через поры в мембране митохондрий в цитозоль выходят цитохром С и фактор APAF–1 (Apoptose protease activation factor 1). APAF–1 освобождается из мембраны митохондрий: фактор Bikвытесняет его из гетеродимера с факторами Вс1–2 или BCL–X_L, В составе которого он удерживается в мембране. APAF–1 и цитохром С в присутствии АТФ образуют комплекс с неактивной каспазой — прокаспазой 9. Этот комплекс называют апоптосомой. В ней под влиянием APAF–1, распознающего гомологичный домен в прокаспазе, происходит активация каспазы 9 [621]. В отличие от рецепторного механизма реализация митохондриального пути включения апоптоза требует экспрессии ряда генов и синтеза de novo РНК и белка.

До активации каспаз процесс развития апоптоза обратим. Блокада распространения апоптотического сигнала по раным путям происходит по-разному. Рецепторный механизм апоптоза может быть прерван благодаря активации группы факторов FLIP (FLICE-inhibitory protein; FLICE — старое название каспазы 8), которые содержат эффекторные домены смерти, свойственные каспазе 8, но лишены её каталитического центра. В результате они конкурентно блокируют действие этой каспазы [556]. Митохондриальный механизм включения апоптоза блокируется упоминавшимися выше антиапоптотическими факторами семейства Вс1–2, прежде всего самим Вс1–2 и Bcl–X_L [600]. Эффект Вс1–2 связан главным образом с его способностью связывать «только-ВН3»–факторы и предотвращать их стимулирующее действие на формирование комплексов Bax-Bak. Bcl–2 способен также связываться непосредственно с Вах и Вак, а также с Apaf–1. Эти механизмы препятствуют формированию трансмембранных пор в митохондриях и/или формированию апоптосом. Необходимо упомянуть также о «сфингомиелиновом реостате» — механизме контроля баланса пролиферации и апоптоза, осуществляемого метаболитами сфингомиелина, среди которых роль проапоптотического фактора принадлежит церамиду.

Итак, оба пути включения апоптоза приводят к активации каспаз. Каспазы — это группа цистеиновых протеаз, которые расщепляют полипептидную связь после остатков аспарагиновой кислоты. Различие отдельных каспаз по специфичности сводится к распознаванию различных тетрапептидов, прилегающих к месту разрыва с NH₂–конца [556]. Рецепторный путь приводит к активации каспазы 8 (реже — каспаз 2 и 10), митохондриальный — к активации каспазы 9. Эти ферменты относятся к группе инициаторных каспаз. В неактивной форме (прокаспазы) они содержат наряду с двумя протеазными доменами два домена смерти (прокаспазы 8 и 10) для взаимодействия с FADD и другими адаптерными белками или домен, рекрутирующий прокаспазу в состав апоптосомы (прокаспазы 9 и 2). Их активация является следствием агрегации, возникающей вследствие взаимодействия с адаптерными белками (FADD, Apaf–1) и вызывающей аутокаталитическое отщепление длинного N–концевого участка. В процессе активации молекулы происходит реорганизация доменов и формирование активного гетеродимера (тетрамер p18/р11-р18/р11 в случае каспазы 8, тример — в случае каспазы 9). После активации инициаторных каспаз процесс апоптоза становится необратимым.

Инициаторные каспазы вызывают частичный протеолиз (отщепление короткого про–домена) и вследствие этого активацию исполнительных или эффекторных каспаз — 3, 6 и 7. Наиболее важной и универсальной по своему участию в осуществлении апоптоза является каспаза 3 [600]. Активная каспаза 3 —это димер p17/р12. Исполнительные каспазы формируются также при действии гранзима В — сериновой протеазы, транспортируемой в клетки–мишени из киллерных лимфоцитов (Т и NK).

Мишенями исполнительных каспаз служат многочисленные белки, значительная часть которых локализуется в ядре [197]. Расщепление молекул–мишеней определяет весь спектр проявлений апоптоза. Одна из главных мишеней каспазы 3 — эндонуклеаза CAD (Caspase–activated DNase) активируется в результате расщепления ингибиторного субкомпонента. Активированная CADосуществляет деградацию ДНК, действуя на доступные для нее участки молекулы, расположенные между нуклеосомами. Расщепление той же каспазой ядерных ферментов PARP(Poly-ADP-Ribose Polymerase), а также ДНК–зависимой протеинкиназы блокирует процесс репарации ДНК. Действие каспаз на фактор ретинобластомы (Rb) и d–изоформу протеинкиназы С определяет нарушение контроля клеточного цикла. Расщепление киназ МNK–1 и FAK приводит к изменениям, имеющим следствием ослабление адгезионной способности клетки, а расщепление гельсолина и киназы РАК определяет характерные изменения клеточной морфологии.

Уже упоминалось, что клетки, подвергающиеся апоптозу, быстро фагоцитируются. Этому способствует экспрессия на поверхности апоптотических клеток ряда молекул, распознаваемых фагоцитами и облегчающих процесс фагоцитоза [217]. Так, при апоптозе нарушается асимметрия мембраны, и фосфатидилсерин, в норме локализующийся на внутренней поверхности мембраны, оказывается экспонированным на поверхности. Он распознаётся молекулой CD14 макрофага и, возможно, другими Рц. Свободные остатки Сахаров, формирующиеся вследствие десиалирования мембранных гликоконъюгатов, распознаются мембранными лектинами фагоцитов. Тромбоспондин, который также появляется на поверхности апоптотических клеток, узнается молекулами адгезии — интегрином a₂b₂ и CD36, через которые сигналы передаются внутрь фагоцитирующей клетки и активируют её метаболизм. Лизосомальная ДНКаза II довершает деградацию ДНК апоптотической клетки уже внутри фагоцита. Благодаря быстрому фагоцитозу и отсутствию выхода внутриклеточного содержимого в межклеточное пространство, погибающая клетка не «загрязняет» его и не вовлекает в процесс гибели соседние клетки, что составляет важное отличие апоптоза от некроза.

В связи с интенсивным фагоцитозом апоптотических клеток их трудно определить in situ. Идентификация процесса апоптоза не ограничивается регистрацией морфологических изменений клеток (это — слишком субъективный показатель). Она основана на ряде особенностей процесса, о которых говорилось выше (рис. 52). Большая часть методов определения апоптоза основывается на выявлении деградации ДНК. Ещё недавно в качестве основного и самого надежного метода определения апоптоза клеток использовался электрофорез фрагментов ДНК, экстрагируемых из клетки: для апоптоза характерна «лесенка», то есть наличие фрагментов, по протяженности кратных длине ДНК в нуклеосоме, что при электрофорезе проявляется в виде дискретных фракций [215]. Для выявления нерепарированных разрывов ДНК используют TUNEL–метод (TdT–mediated dUTR-biotin Nick End Labeling), основанный на катализируемом терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой (TdT) подсоединении к свободному 3'–концу нити ДНК меченых нуклеотидов с последующим обнаружением меченых клеток иммуногистохимическими или цитофлуорометрическими методами [248]. В качестве скрининг–метода используют цитофлуорометрическое выявление гиподиплоидных клеток (т.е. клеток, потерявших часть ДНК вследствие её деградации), с помощью окрашивания пропидия йодидом [371]. Ещё один широко распространённый цитофлуорометрический метод определения апоптоза используется для обнаружения экспрессии клетками фосфатидилсерина, который способен связывать аннексии V, меченный флуорохромом [572]. Комбинирование окрашивания аннексином и пропидия йодидом позволяет дифференцировать апоптотические и некротические клетки (только последние окрашиваются пропидием без предварительной фиксации).

Рис. 52. Методы определения апоптоза. а — схемы электрофореграмм олигонуклеотидов, иллюстрирующие различные проявления деградации ДНК при апоптозе (слева — «лесенка», отражающая последствия межнуклеосомной деградации ДНК с формированием дискретных фракций) и некрозе (справа — сплошное пятно, отражающее неупорядоченную деградацию ДНК), б — гистограмма, полученная при цитофлуорометрическом анализе фиксированных клеток, окрашенных на ДНК пропидия йодидом. Основной пик соответствует диплоидным клеткам, пик справа — клеткам, находящимся в клеточном цикле, пик слева, отмеченный курсором М1 — гиподиплоидным клеткам, утратившим часть ДНК в результате апоптоза — 28, 7% от общего числа, в — результаты цитофлуорометрического анализа нефиксированных клеток, окрашенных конъюгатом аннексина V с изотиоцианатом флуоресцеина (по оси абсцисс) и пропидия йодидом (по оси ординат). Жизнеспособные клетки присутствуют в левом нижнем квадранте. В правом нижнем квадранте содержатся клетки, подвергшиеся апоптозу (связывают аннексии V, но непроницаемы для пропидия йодида), в левом верхнем квадранте — клетки, подвергшиеся некрозу (непроницаемы для пропидия йодида, не связывают аннексии V), в правом верхнем квадранте — как полагают, клетки, подвергшиеся апоптозу, который перешел в некроз.