цКЮБМЮЪ ЯРПЮМХЖЮ яКСВЮИМЮЪ ЯРПЮМХЖЮ
йюрецнпхх:
юБРНЛНАХКХюЯРПНМНЛХЪаХНКНЦХЪцЕНЦПЮТХЪдНЛ Х ЯЮДдПСЦХЕ ЪГШЙХдПСЦНЕхМТНПЛЮРХЙЮхЯРНПХЪйСКЭРСПЮкХРЕПЮРСПЮкНЦХЙЮлЮРЕЛЮРХЙЮлЕДХЖХМЮлЕРЮККСПЦХЪлЕУЮМХЙЮнАПЮГНБЮМХЕнУПЮМЮ РПСДЮоЕДЮЦНЦХЙЮоНКХРХЙЮоПЮБНоЯХУНКНЦХЪпЕКХЦХЪпХРНПХЙЮяНЖХНКНЦХЪяОНПРяРПНХРЕКЭЯРБНрЕУМНКНЦХЪрСПХГЛтХГХЙЮтХКНЯНТХЪтХМЮМЯШуХЛХЪвЕПВЕМХЕщЙНКНЦХЪщЙНМНЛХЙЮщКЕЙРПНМХЙЮ
кАКИЕ СУБЪЕДИНИЦЫ АХР ВЫСТРАИВАЮТ ПОРУ.
|
|
Для получения информации об устройстве выстилки поры ионного канала был активно использован сайт-направленный мутагенез субъединиц АХР. Несмотря на наличие общих представлений о третичной структуре субъединиц АХР, наши знания о точном топологическом расположении трансмембранных сегментов и их участии в формировании стенки ионного канала гораздо более поверхностны. Такие характеристики исключительно важны, поскольку структура поры определяет ионную избирательность и проводимость канала. Один из подходов к решению данной проблемы состоит в проведении одной или нескольких мутаций в участке белка, предположительно вовлеченном в выстилку поры, и регистрации следующих за этим изменений избирательности и проводимости канала.
Другой подход может базироваться на способности стенки ионного канала связывать молекулы с определенными физико-химическими свойствами. Например, молекула местного анестетика QX-222 может блокировать ток через ионный канал за счет связывания с определенным сайтом внутри открытого канала АХР. Мутации субъединиц АХР показали, что М2 домены формируют часть стенки открытого канала 16), как изображено на рис. 3.4А. В частности, М2 домены a- и d - субъединиц АХР мыши содержат следующие аминокислотные последовательности (направление от цитоплазмы к внеклеточной среде, с нумерацией, относящейся к a-субъединице; рис. 3.2):
Можно предположить, что гидрофильные аминокислоты, такие как серии (S) или треонин (Т), скорее всего обращены к водной поре, в то время как гидрофобный изолейцин (I) будет более вероятно контактировать с мембранными липидами. Когда серии из указанных позиций (отмечено подчеркиванием) был заменен слабо гидрофобным аланином, проводимость модифицированных ионных каналов снизилась почти наполовину. Кроме того, у мутантных каналов резко снизился аффинитет для QX— 222. Эти эффекты согласуются с идеей о том, что серии образует стенку водной поры ионного канала АХР и вносит вклад в функциональные свойства ионного канала. Предполагается, что все выделенные на приведенном рисунке аминокислоты в составе a-субъединицы принимают участие в образовании контура водной поры. Эти остатки были идентифицированы в экспериментах Карлин с коллегами 17), в которых каждый аминокислотный остаток a-субъединицы от М243 до V261 по очереди заменяли на цистеин. Мутантная a-субъединица была затем экспрессирована в ооциты вместе с интактными b, g и d-субъединицами. Мембранные токи, продуцируемые АХ, измерялись до и после действия гидрофильного реагента MTSEA (этиламмония метанэтиосульфонат). Реагент мог избирательно реагировать с сульфгидрильной группой цистеина только в том случае, если замешенный цистеин находился в водной фазе. MTSEA ослаблял ответы на АХ (за счет блока ионного канала) в тех случаях, когда мутациям подвергались аминокислоты, выделенные на рисунке (Т244, L245, S248, L250, L251, S252, V255, L258). Эти результаты предполагают модель устройства стенки водной поры, образованной регулярной спиралью белковой молекулы, прерванной в середине вытянутой структурой, содержащей остатки 250, 251 и 252.
Глава 3. Структура ионных каналов 55
| ∙ Рис 3.4. Модель структуры субъединицы АХР, базирующаяся на электронно-микроскопическом изображении. (А) Три спиральных элемента находятся во внеклеточной части канала, окружая и формируя устье АХР, обращенное в синаптическую щель. В пределах плоскости мембраны участки Ml, МЗ и М4 образуют крупные b-спирали. М2 представляет собой изломанную мелкошаговую α -спираль, обращенную в просвет поры. (В) Поперечный срез рецептора, состоящего из пяти субъединиц. | 
|
| Fig. 3.4. Proposed Model of the AChR Subunit Structure, based on electron microscope imaging. (A) Three helical elements lie within the extracellular region around the synaptic vestibule. Within the plane of the membrane, regions MX M3, and M4 form a b sheet. M2 is a split a helix extending into the pore region. (B) Cross sections of the complete receptor, consisting of five subunits, in the plane of the membrane. In the closed receptor, the M2 helices extend into the core of the structure. An open pore is created by the rotation of each helix toward the channel wall. The model is not in agreement with biochemical experiments that suggest that the gate is closer to the cytoplasmic end of the pore. |