Соединение гамет у млекопитающих

До сих пор наше обсуждение касалось тех организмов, у которых оплодотворение происходит во внешней среде. У млекопитающих оплодотворение внутреннее и процесс оплодотворения приспособлен к внутренней среде организма. И в самом деле, было обнаружено, что у млекопитающих половые пути самки принимают активное участие в процессе оплодотворения. Спермии млекопитающих сразу после эякуляции не способны к акросомной реакции; для того чтобы эта реакция стала возможной, спермиям необходимо в течение некоторого времени находиться в половых путях самки. Условия, требующиеся для капацитации (приобретения спермиями оплодотворяющей способности), варьируют в зависимости от вида (Gwatkin, 1976); пребывание спермиев в половых путях самки может быть заменено их инкубацией in vitro в жидком содержимом яйцеводов или матки. Одна из гипотез относительно природы процесса капацитации постулирует, что процесс этот заключается в изменениях структуры липидов клеточ-

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. I: Пер. с англ. — М.: Мир, 1993. — 228 с.

Рис. 2.14. Видоспецифическая агглютинация яиц, освобожденных от студенистой оболочки, при добавлении биндина А, Агглютинацию вызывает добавление 213 mkг биндина в пластмассовую чашку, содержащую 0.25 мл 2% -ной (по объему) суспензии яиц. В течение 2-5 мин чашку осторожно покачивают и затем фотографируют (пояснительная схема сделана по фотографиям Glabe, Vacquier, 1977). Б. Микрофотография флуоресцирующих яиц S. purpuratus, соединенных друг с другом частицами биндина S. purpuratus, меченными флуоресцеином. В местах, где два яйца соприкасались, неизменно присутствовали частицы биндина. (Из Glabe, Lennarz, 1979: фотография с любезного разрешения авторов.)

Рис. 2. 15. Локализация биндина на акросомном выросте. А, Иммунохимический метод выявления локализации биндина. Кроличьи антитела взаимодействуют с обнажившимся биндином. Затем к этим антителам добавляют ковалентно связанные с молекулой пероксидазы антитела свиньи против кроличьих антител. Пероксидаза катализирует реакцию между диаминобензидином (ДАВ) и перекисью, в результате которой образуется электроноплотный осадок. Таким образом, этот осадок будет возникать только там, где имеется биндин. Б.Локализация биндина на акросомном выросте после акросомной реакции (х 133 200). В. Локализация биндина на акросомном выросте в месте соединения спермия с яйцом. (Б и В -- из Moy,. Vacquier. 1979; фотографии с любезного разрешения V. D. Vacquier.)

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. I: Пер. с англ. — М.: Мир, 1993. — 228 с.

48 ГЛАВА 2

Рис. 2.16. Микрофотография спермиев морского ежа, прикрепившихся к желточной оболочке яйца, полученная с помощью сканирующего электронного микроскопа. (Фотография с любезного разрешения С. Glabe, L. Perez. W.J. Lennarz.)

ной мембраны спермии. Это представление основывается на исследованиях (Davis et al., 1980), которые показывают, что соотношение холестерин: фосфолипиды в мембране спермия по мере капацитации снижается и что молекулы альбумина, имеющиеся в половых путях самки, способны отнимать холестерин у спермия. Продолжительность капацитации различна у разных видов и тесно коррелирует с временем, требующимся для изменения соотношения холестерин: фосфолипиды (Davis. 1981). Полагают, что снижение содержания холестерина дестабилизирует мембрану акросомного пузырька и что без таких изменений липидного состава слияние мембран, наблюдающееся при акросомной реакции, не может осуществиться. Вместе с тем при капацитации с поверхности спермия удаляются особые, связанные с ней вещества (" coating factors"), которые, оставаясь на поверхности, препятствуют оплодотворению (Yanagimachi. 1981).

Вопрос о том, как инициируется акросомная реакция у млекопитающих, остается спорным: местонахождение спермиев в момент ее инициации у разных видов может быть различным. Это различие, вероятно, сопряжено с разной способностью спермиев проникать через лучистый венец, окружающий яйцо. У некоторых видов акросомная реакция происходит, по-видимому, в то время, когда спермий находится на некотором расстоянии от яйца. Так, например, по имеющимся данным, у кролика акросомная реакция может быть индуцирована растворимыми веществами, выделяемыми яйцом (Bedford, 1968), тогда как у морской свинки она происходит в определенное время независимо от присутствия яиц (Yanagimachi. Usui, 1974). В этих случаях акросомная реакция приводит к выделению ферментов, лизирующих связи между клетками лучистого венца (Zaneveld, Williams. 1970; Williams. 1972). Выделенные ферменты, называемые лизинами, включают гиалуронидазу, расщепляющую гиалуроновую кислоту, которая составляет большую часть внеклеточного матрикса. и фермент, рассеивающий клетки лучистого венца, специфическим образом разрушая связи между ними. С помощью этих ферментов спермий проходит через лучистый венец и достигает прозрачной оболочки яйца.

У наиболее хорошо изученных млекопитающих мыши и хомячка акросомная реакция происходит после прикрепления спермия к прозрачной оболочке (Saling et al., 1979; Florman, Storey. 1982; Cherr et al.. 1986). У этих животных спермии способны, по-видимому, проникать через лучистый венец, не выделяя больших количеств гиалуронидазы (Talbot at al.. 1985).

Прозрачная оболочка яиц млекопитающих выполняет такую же роль, как и желточная оболочка у иглокожих. Прикрепление спермия к прозрачной оболочке лишь относительно, а не абсолютно видоспецифично (видовая специфичность при внутреннем оплодотворении — не столь важная проблема). Спермии мыши можно лишить способности прикрепляться к прозрачной оболочке яиц своего вида, если их предварительно инкубировать с гликопротеина-

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. I: Пер. с англ. — М.: Мир, 1993. — 228 с.

_______________ ОПЛОДОТВОРЕНИЕ: ВОЗНИКНОВЕНИЕ НОВОГО ОРГАНИЗМА _____________ 49

ми этой оболочки. В ном опыте активным конкурентом яйца является гликопротеин с молекулярной массой 83000 дальтон (ZP3), выделенный из прозрачной оболочки (Bleil, Wassarman. 1980, 1986; см. рис. 2.17). Таким образом, в прозрачной оболочке содержится особый гликопротеин, к которому прикрепляется спермий. После того как прикрепление произошло, тот же самый белок, как было показано, возбуждает акросомную реакцию. Это позволяет спермию мыши концентрировать свои протеолитические ферменты непосредственно в месте прикрепления к прозрачной оболочке.

Спермии всех млекопитающих содержат лизин, разрушающий прозрачную оболочку в месте прикрепления (Stambaugh, Buckley. I960). Этот лизин, называемый акрозином, по аминокислотной последовательности очень сходен с трипсином, и чтобы начать работать, он, подобно трипсину, должен быть активирован. Было установлено (Wincek et al., 1979; Stambaugh, Mastroianni, 1980), что акрозин, находящийся в акросомном пузырьке, неактивен, но под воздействием гликопротеина из половых путей самки происходит его активация. Здесь мы опять убеждаемся в том, что половые пути самки являются не просто каналами для проведения спермы, но и активными участниками процесса оплодотворения.

Молекулярный механизм, с помощью которого прозрачная оболочка яйца и спермий млекопитающих узнают друг друга, полностью еще не изучен. Распространенная гипотеза, предложенная для объяснения механизма соединения гамет у млекопитающих, постулирует существование на поверхности спермия белка, способного узнавать видоспецифический углевод гликопротеина прозрачной оболочки (Wassarman, 1987). Показано (Horrnun et al., 1984; Florman. Wassarman, 1985), что у мыши важную роль в узнавании спермия прозрачной оболочкой Играет углеводная группа на гликопротеине ZP3. После удаления этих углеводных групп ZP3 утрачивает способность конкурировать за прикрепление спермия (однако для инициации акросомной реакции, по-видимому, необходима вся молекула гликопротеина). В лаборатории Шура (Shur, Hall, 1982a.b; Lopez et al., 1985) с использованием другого подхода было показано, что рецепторы спермия для прозрачной оболочки представляют собой фермент на поверхности его головки, который узнает сахар N-ацетилглюкозамин (рис. 2.18.4). Этот фермент (N-ацетилглюкозамин: галактозилтрансфераза) встроен в плазматическую мембрану спермия непосредственно над акросомой, причем его активный центр обращен наружу. Эта гликозилтрансфераза, вероятно, катализирует присоединение галактозы к углеводной цепи, оканчивающейся N-ацетилглюкозамином. Однако в половых путях самки отсутствуют активированные остатки галактозы. Поэтому, хотя фермент может присоединяться к N-ацетилглюкозаминовым остаткам белков zona pellucida (возможно, к ZP3. что, однако, еще не установлено) точно так же, как любой фермент соединяется с субстратом, он не может катализировать реакцию, поскольку второй ее участник отсутствует. В результате ферменты (на спермии) остаются связанными со своими субстратами (на яйце).

Рис. 2.17. Прикрепление спермия к прозрачной оболочке. А. Опыт, показывающий специфическое снижение доли спермиев, прикрепившихся к прозрачной оболочке, при инкубации оболочек и спермиев мыши с возрастающими количествами гликопротеина ZP3. Этот рисунок демонстрирует также значение углеводной части ZP3. Б. Прикрепление ZРЗ с радиоактивной меткой к капацитированным спермиям мыши. (А — по Bleil, Wassarman. 1980: Florman. Wassarman. 1985; A — из Bleil, Wassarman. 1986; с любезного разрешения авторов.)

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. I: Пер. с англ. — М.: Мир, 1993. — 228 с.

50________________ ГЛАВА 2______________________________________________________________________________

Рис. 2.18. Галактозилтрансфераза спермиев мыши. А. Флуоресцирующие антитела к галактозилтрансферазе спермиев мыши выявляют ее в плазматической мембране спермия над акросомой. Б. Модель уэнавания спермием и яйцом друг друга. Поверхность спермия содержит фермент, галактозилтрансферазу, способную узнавать концевые остатки N-ацетилглюкозамина. В спермиях, не прошедших капацитации, активные центры этого фермента блокированы связанными с их поверхностью углеводами, включающими остатки N-ацетилглюкозамина (NAr) и галактозы (Гaл). При капацитации эти углеводы отделяются от поверхности спермия, освобождая активные центры галактозилтрансфераз. Теперь галактозилтрансферазы могут узнавать N-ацетилглюкозаминовые остатки в молекуле гликопротеина ZP3 на поверхности прозрачной оболочки. Представленная модель объединяет результаты многих исследований, однако идентичность галактозилтрансферазного рецептора с ZP3 до сих пор не доказана. (По Lopez et al.. 1985: фотография с любезного разрешения В. Shur.)

Если приведенная гипотеза справедлива, то прикрепление спермия можно предотвратить ингибированием фермента или добавлением второго участника реакции – активированной галактозы. Именно такой результат и был получен Шуром с сотрудниками: как при ингибировании гликозилтрансферазы (антителами), так и при завершении реакции (путем добавления УДФ-галактозы) спермий к яйцу не прикреплялся. Эти данные позволили связать обнажение гликозилтрансферазы на поверхности спермия с его капацитацией. Уже около десятка лет известно, что одно из проявлений капацитации — приобретение спермием способности узнавать прозрачную оболочку яйца. На поверхности спермия, не прошедшего капацитации, находятся углеводы (" coating factors"), которые препятствуют его прикреплению к яйцу. При капацитации эти углеводы удаляются, а когда их добавляют к капацитированным спермиям, то спермии утрачивают способность прикрепляться к яйцам. Углеводы, блокирующие прикрепление спермия, представляют собой, по-видимому, полимер из повторяющихся остатков галактозы и N-ацетилтлюкозамина — именно тот тип молекулы, который способен связывать активный центр гликозилтрансферазы в головке спермия. Объединение накопленных данных позволяет создать модель, представленную на рис. 2.18.Б. Прозрачная оболочка выступает как носитель субстрата остатков N-ацетилглюкозамина, а спермий - молекул гликозилтрансферазы, которые к этим остаткам прикрепляются. Капацитация обнажает гликозилтрансферазы на поверхности спермия, и их соединение с N-ацетилглюкозаминовыми остатками прозрачной оболочки по типу ключ-замок прикрепляет спермий к яйцу. Такая же гликозилтрансфераза была обнаружена в спермиях морской свинки и человека, но ее роль в соединении гамет у этих видов предстоит еще выяснить.