Связывание и функция TFIIIA

Сайты связывания TFIIIA в гене 5S-pPHK были определены с помощью мутационного анализа, картирования (футпринтинга) ДНКазой I, метилирования гуанозинов и блокирования фосфатов (Sakonju, Brown, 1982; Pieler et al., 1985). По результатам мутационного анализа были установлены три

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

__________________ ИЗМЕНЕНИЕ ТРАНСКРИПЦИИ В ХОДЕ РАЗВИТИЯ ___________________________________ 129

Рис. 11.27. Схема взаимодействия между TFIIIA и внутренней контролирующей областью соматического гена 5S-pPHK Xenopus. Гуанозиновые остатки, метилирование которых влияет на связывание TFIIIA помещены в прямоугольники серого цвета. Фосфатные группы в ДНК, которые контактируют с TFIIIA, указаны черными треугольниками; последовательности ДНК. защищенные белком TFIIIA от гидролиза ДНКазой 1, подчеркнуты. Основания, которые отличаются в ооцитном гене 5S-pPHK, приведены под цепью ДНК. (По Sakonju, Brown, 1982.)

участка, необходимые для правильной транскрипции: нуклеотиды в положениях 50-61, 70-71 и 80-89. Последовательность нуклеотидов 50-61 обнаружена во всех других генах, транскрибируемых РНК-полимеразой III. В этом консервативном участке соматический 5S-ген отличается от ооцитного 5S-гена, и это различие, как полагают, обеспечивает разное сродство этих двух генов к TFIIIA. «Футпринтинг» ДНКазой 1 осуществляется путем присоединения белка (в данном случае TFIIIA) к радиоактивной ДНК и последующего переваривания ДНК с помощью этой относительно неспецифической ДНКазы. Полученную ДНК вносят в гель и разделяют электрофорезом, как при секвенировании. При этом получают ожидаемую олигонуклеотидную «лестницу», характерную для секвенирующих гелей, где каждый олигонуклеотид на одно основание короче, чем олигонуклеотид, лежащий выше его. Однако в тех участках, где ДНК защищена белком от гидролиза ДНКазой, соответствующие олигонуклеотиды отсутствуют. Результат такого опыта в случае связывания TFIIIA с геном 5S-PHK из ооцита Xenopus представлен на рис. 11.26. Отчетливо видны три сайта связывания. Можно выяснить, меняется ли данный характер защиты нуклеотидов в ДНК при модификации остатков гуанозина (метилированием) или фосфатных групп (этилированием). Метилирование определенных групп гуанозинов (70 и 71; 80-89) и этилирование определенных групп фосфатов (70 и 71; 80-87) подавляет связывание TFIIIA и предотвращает защиту этим белком указанных участков ДНК. Эти данные суммированы на рис. 11.27; они выявляют три сайта связывания TFIIIA на гене 5S-PHK.

Если в SS-промоторе присутствуют три основных участка связывания TFIIIA, то в белке TFIIIA имеются девять доменов, связывающих ДНК. Каждый из этих «ДНК-связывающих пальцев» представляет собой глобулярный домен, в центре которого находятся преимущественно основные аминокислоты. Эти домены соединены друг с другом тандемно. и каждый стабилизирован ионом цинка, расположенным в центре домена (рис. 11.28). Предполагается, что такое строение позволяет TFIIIA удерживаться на гене при движении по нему РНК полимеразы (Miller et al., 1985). Если одни из связывающих доменов открепляются, то прикрепление к ДНК будут обеспечивать другие домены.

Какая из функций TFIIIA делает его необходимым для транскрипции? Группой исследователей (Kmiec, Worcel, 1985; Kmiec et al., 1986) было высказано предположение, что роль TFIIIA заключается

Рис. 11.28. Сопоставление структур белка – регулятора транскрипции TFIIIA и внутренней контролирующей области молекулы ДНК. А. Ориентация белка по отношению к ДНК. Девять «пальцев», связывающихся с SS-промотором, экспонированы. Б. Детальный вид ДНК-связывающих «пальцев», стабилизированных цинком; основные остатки (черные кружки) присоединяются к ДНК. (По Miller et al., 1985.)

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

130 _______________ ГЛАВА 11 _______________________________________________________________________________

в индукции изгибов ДНК, вызывающих расхождение двух нитей спирали. Белок TFIIIA вызывает, по-видимому, изменение конформации гена 5S-pPHK. когда их добавляют друг к другу в присутствии ядерного экстракта. Хотя эти данные противоречивы (Wolffe et al., 1987), они привлекают внимание к интересному направлению в исследованиях регуляции транскрипции генов 5S-PHK.

Контроль детерминации на уровне транскрипции: гены переключения путей дифференцировки дочерних клеток

До сих пор при обсуждении контроля на уровне транскрипции мы рассматривали те гены, продукты которых являются следствием дифференцировки, а не их причиной. Синтез глобинов, например, не является последней стадией в дифференцировке эритроцитов. Существуют ли случаи, когда транскрипция способна заставить клетку стать клеткой крови вместо того, чтобы стать клеткой кости? Могут ли гены, активные на ранних этапах развития, определять судьбу клетки? В 1940 г. Уоддингтон, один из наиболее прозорливых теоретиков биологии развития, предсказал существование «генов-переключателей». Эти гены, по его словам, могут работать как стрелки на сортировочной станции, которые определяют, по какому нуги следовать поезду (рис. 11.29). Такие гены могли бы обеспечивать тем или иным способом активацию батареи генов для какого-то одного пути развития, а не для другого, альтернативного.

Недавно была открыта группа генов, которые имеют свойства таких «генов-переключателей». Клетки, в которых экспрессируются гены-переключатели, имеют возможность дать потомство одного из двух клеточных типов, и наличие или отсутствие продуктов этого гена определяет, какое потомство будут генерировать эти клетки.

Локус lin-12 у круглого червя Caenorhabditis elegans контролирует два альтернативных клеточных типа (Greenwald et al., 1983). У зародышей дикого типа имеются две соседние клетки, Zl.ppp и Z4.aaa, которые взаимодействуют друг с другом (Kimble, 1981). Любая из этих клеток может дать начало якорной клетке матки (ас), тогда как другая клетка будет формировать предшественник брюшной клетки матки (vu). У мутантов, рецессивных по локусу lin-12, соответствующий ген не транскрибируется. Обе клетки становятся якорными клетками. У мутантов, доминантных по этому локусу, у которых уровень транскрипции lin-12 очень высок, обе клетки становятся предшественниками брюшных клеток матки (табл. 11.3). Ген lin-12 контролирует, по-видимому, бинарное переключение с одного альтернативного пути развития на другой. Один из наиболее интересных аспектов функционирования гена lin-12 заключается в том, что он определяет один из двух путей развития для нескольких клеток в различных частях тела. Как указано в таблице, брюшные и спинные m(l/r)pa-клетки становятся соответственно половыми мезобластами и целомоцитами. В случае если в клетках произошла доминантная мутация по гену lin-12, обе клетки становятся половыми мезобластами; если же мутация оказывается рецессивной, то обе клетки становятся целомоцитами.

Мутация Notch у дрозофилы также направляет бипотенциальную клетку по одному из двух альтернативных путей. В этом случае происходит выбор между клеткой кожи (гиподермы) или нейробластом. Вскоре после гаструляции зона приблизительно из 1800 эктодермальных клеток располагается по средней линии вдоль вентральной стороны зародыша дрозофилы. Эти клетки формируют брюш-

Рис. 11.29. Фотография сортировочной станции, сделанная Джозефом Нидхэмом (J. Needham, 1936) для иллюстрации гипотезы своего друга и коллеги Ч. Уоддингтона. Рельсы символизируют различные пути развития, по которым могут следовать вагоны. Хорошо видны разветвления путей.

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

___________ ИЗМЕНЕНИЕ ТРАНСКРИПЦИИ В ХОДЕ РАЗВИТИЯ _________________________________________ 131

Таблица 11.3. Детерминация клеток у мутантов по гену lin-12
Мутации	Клетки
	Z1.ppp	Z4.aaa	M.v.(1/r)pa	M.d. (1/r)pa

ную нервную цепочку насекомого, и примерно четверть из них становятся нейробластами, тогда как оставшиеся становятся предшественниками клеток гиподермы. Клетки, которые дают начало нейробластам, перемешаны с теми клетками, которым предопределено дать начало гиподермальным предшественникам. Таким образом, у зародыша дрозофилы каждая клетка эктодермы в области формирования нервной цепочки может дать начало предшественникам либо гиподермальных, либо нервных клеток (Hartenstein, Campos-Ortega, 1984). В отсутствие транскрипции гена Notch у зародыша клетки развиваются в предшественников нервных клеток, а не в смесь предшественников гиподермальных и нервных клеток (рис. 11.30; Lehmann et al., 1983; Artavanis-Tsakonis et al., 1983). Эти зародыши погибают из-за большого избытка нервных клеток и отсутствия брюшной и головной гиподермы (Poulson, 1937; Hoppe, Greenspan, 1986). Ген Notch был клонирован (Kidd et al., 1983; Yedvobnick et al., 1985), и было обнаружено, что он транскрибируется в течение первой половины эмбриогенеза (и позднее на стадии ранней куколки) (рис. 11.31).

Последовательности обоих генов Notch и lin-12 – в значительной степени гомологичны последовательности фактора роста эпидермиса (ФРЭ) – важного регулятора роста клеток млекопитающих (гл. 20). N-концевая половина белкового продукта гена Notch содержит 36 тандемных копий ФРЭ-подобных пептидных последовательностей, каждая

Рис. 11.30. Иллюстрация проявления мутации Notch. У зародышей дикого типа нейрогенные клетки эктодермы дают начало как нейробластам, так и клеткам кожи (гиподерме) У зародышей Notch все клетки нейрогенной эктодермы развиваются в нейробласты.

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

132 _____________ ГЛАВА 11 ____________________________________________________________________________

Рис. 11.31.Нозерн-блот транскрипции гена Notch дикого типа на различных стадиях развития Drosophila. Числами указаны часы развития при 25° С. Максимальная транскрипция приходится на 6–7 ч после откладки яиц. (Из Yedvobnick et al., 1985; фотография с любезного разрешения S. Artavanis-Tsakonas.)

Рис. 11.32. Гибридизация in situ, показывающая локализацию мРНК гена sevenless дикого типа. Срезы для микроскопии инкубировали с радиоактивным рестрикционным фрагментом гена sevenless дикого типа и затем проводили радиоавтографию. А. Окрашенный срез, на котором видны области мозга личинки (br, pv, vs) и глазного диска (ed) Б. Меченая ДНК гибридизуется с мРНК только в той части имагинального диска личинки, которая станет сетчаткой взрослого организма. (Из Hafen et al., 1987; фотография с любезного разрешения Е. Hafen.)

из которых, как полагают, выпячивается из клеточной мембраны (Wharton el al., 1985). Сходным образом продукт гена lin-12 имеет по меньшей мере 11 ФРЭ-подобных повторов; полагают, что они также выступают за клеточную поверхность. Было высказано предположение, что многомерные ФРЭ-участки могут связывать клетки друг с другом и действовать как стимулятор митоза (Burgess, 1987). В случае мутантов Notch, у которых функция этого гена нарушена, такие агрегаты делящихся клеток не способны развиваться в клетки гиподермы, т.е. они будут предназначены для образования нейробластов.

Если гены-переключатели lin-12 и Notch кодируют продукты, напоминающие связанные с мембраной факторы роста, то другой ген-переключатель – sevenless - кодирует белок, который похож на связанный с мембраной рецептор фактора роста. Этот ген активен в имагинальных дисках глаза у личинок последнего возраста дрозофилы (рис. 11.32). Он контролирует переключение, определяющее, какая клетка возникнет из клетки сетчатки: седьмой фоторецептор (ультрафиолетчувствительная нервная клетка) или ненейральная колбочка. Надлежащая транскрипция гена sevenless необходима для коммитирования клетки к формированию этого нейрона, и в отсутствие полноценного функционирования гена sevenless все бипотенциальные клетки станут предшественниками колбочек (Banerjee et al., 1987; Hafen et al., 1987).

Три описанных гена контролируют переключение развития, при котором бипотенциальной клетке разрешается следовать по одному из двух альтернативных путей дифференцировки. Во всех трех случаях межклеточные взаимодействия играют, по-видимому, критическую роль. Структура каждого из белковых продуктов этих генов свидетельствует о том, что этот продукт связан с мембраной и способен взаимодействовать с поверхностями других клеток. На повестке дня изучение механизмов, посредством которых такие взаимодействия контролируют судьбу клеток.

Дополнительные сведения и гипотезы: Детерминация клеток вульвы у Caenorhabditis elegans

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

__________________ ИЗМЕНЕНИЕ ТРАНСКРИПЦИИ В ХОДЕ РАЗВИТИЯ _______________________________________ 133

Рис. 11.33. Детерминация и проявление фенотипа в ряду клеток вульвы у нематоды С. elegans. Детерминация определяется близостью к якорной клетке, которая вызывает деление клетки Р6.р с образованием восьми клеток вульвы, при этом клетки Р5.р и Р7.p продуцируют по семь клеток вульвы каждая. Три других потенциальных предшественника клеток вульвы не детерминируются к образованию вульвы, а формируют вместо этого гипобласт. Различные мутации могут изменить детерминацию этих клеток или проявление их детерминированного состояния. (По Ferguson et al., 1987.)

гонад. Этот сигнал (пока не идентифицирован, но полагают, что он представляет собой способную к диффузии молекулу) действует в зависимости от положения на шесть клеток (Р(3-8).р), способных формировать ткань вульвы (рис. 11.33). Клетка, ближайшая к якорной клетке (обычно Р6.р). стимулируется к трем симметричным циклам митоза для формирования клеток вульвы. Две клетки, лежащие по обе стороны от нее (Р5.р и Р7.р), подвергаются делению, незначительно отличающемуся от обычного; в результате также возникают клетки вульвы. Три других потенциальных предшественника не предназначаются для образования клеток вульвы: они делятся один раз и дают клетки, входящие в гиподерму нематоды.

Обнаружено более двух десятков мутаций, нарушающих развитие вульвы. С помощью конструирования двойных мутантов, у которых один зародыш несет две отдельные мутации, влияющие на развитие вульвы, можно определить, какие гены активны ранее других, и, следовательно, постулировать генетическую программу. Возможность наблюдать деление каждой клетки, входящей в вульву, позволяет указать точное место, где данная мутация проявляется впервые, и установить соответствие между генетической программой и развитием (Ferguson et al., 1987).

Первый набор генов в генетической программе и программе развития составляют те гены, которые контролируют образование предшественников клеток вульвы и якорной клетки. Как упоминалось ранее, ген lin-12 контролирует формирование якорной клетки таким образом, что у мутантов, доминантных по гену lin-12. она не образуется (оба возможных предшественника якорной клетки становятся клетками матки). В отсутствие якорной клетки возможные предшественники клеток вульвы делятся, чтобы образовать клетки гиподермы.

Второй набор генов детерминирует дифференцировку предшественников клеток вульвы. У таких мутантов, как lin-12, все возможные предшественники клеток вульвы ведут себя подобно клеткам Р3.р, Р4.р и Р8.р. Иными словами, они все дают начало клеткам гиподермы, и вульвы не образуется. Напротив, у мутантов, подобных lin-15, все шесть клеток-предшественников ведут себя как предшественник Р6.р и формируют ткань вульвы. Эти мутанты имеют несколько вульв. Проявление этих мутаций детерминации не зависит от силы индукционного сигнала якорной клетки и определяется, очевидно, на уровне рецепции и ответа на этот сигнал. (До сих пор не обнаружены мутанты, у которых отсутствует сигнал якорных клеток, какой бы природы он ни был.)

Третий набор генов отвечает за проявление детерминированного фенотипа. Три гена, lin-11. lin-17 и lin-18, контролируют, по-видимому, фенотип потомков клеток P5.p и Р7.р. влияя на направление, в котором следует делиться этим клеткам-предшественникам. В этих случаях дочерние клетки напоминают потомков Р6.р, а не потомков Р5.р или Р7.р. Такое изменение в характере деления может привести к распределению конкретных морфогенетических детерминантов по разным областям цитоплазмы.

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

134 _______________ ГЛАВА 11 _________________________________________________________

РЕЗЮМЕ

Дифференциальная экспрессия генов может регулироваться на уровне транскрипции несколькими способами. Например, при гетерохроматизации значительные по размерам части хромосом могут стать генетически инертными: в случае глобиновых генов и генов овальбумина конкретный ген может быть активирован в клетке определенного типа и в определенное время. В некоторых случаях, когда требуются большие количества обычного продукта того или иного гена (как для рибосомных генов ооцитов амфибий), гены могут быть амплифицированы (для 40S-PHK) и могут синтезироваться позитивные транскрипционные факторы (TFIIIA для 5S-pPHK). Регуляция на уровне транскрипции может также определять судьбу клеток. Транскрипция таких «генов переключателей путей дифференцировки дочерних клеток» играет существенную роль в детерминации клеток. В этой главе мы увидели, что определенные гены находятся под дифференциальным контролем на уровне транскрипции Но как осуществляется эта регуляция? Молекулярные механизмы дифференциальной транскрипции генов будут рассмотрены в гл. 12.

ЛИТЕРАТУРА

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

__________________ ИЗМЕНЕНИЕ ТРАНСКРИПЦИИ В ХОДЕ РАЗВИТИЯ ____________________________________ 135

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

136 _______________ ГЛАВА 11 ________________________________________________________________________

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

Глава 12. Регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции: механизмы дифференциальной транскрипции генов

В чем бы ни заключалась конкретная работа генов, их функционирование можно отнести с уверенностью к категории процессов развития и. следовательно, к области эмбриологии. В настоящее время эта центральная проблема фундаментальной биологии атакуется со многих сторон как физиологами, так и генетиками; но в сущности она является эмбриологической проблемой.

К. УОДДИНГТОН (1956)

Мы вошли в клетку, нашу колыбель, и начали составлять опись обретенного нами богатство.

АЛЬБЕР КЛОД (1974)