Экзоны и интроны

Одно из самых удивительных открытий семидесятых годов, десятилетия, отмеченного выдающимися открытиями, – выяснение структуры эукариотического гена. Генетики, изучающие бактерий, пришли к выводу, что белковый продукт колинеарен кодирующему его гену, т.е. 5’-конец РНКопределяет аминоконцевую аминокислоту белка, и каждый кодон транслируется в аминокислоту до тех пор. пока не будет достигнут карбоксильный конец белка. В 1977 г. было обнаружено, что в случае некоторых мРНК эукариот дело обстоит иначе. Большинство расшифрованных с тех пор эукариотических генов оказались разорванными. Иными словами, 5'- и 3'-концы информационной РНК не происходят из одного непрерывного участка хромосомы. Между участками ДНК, кодирующими белок (экзонами), лежат промежуточные последовательности (интроны), которые не имеют никакого отношения к аминокислотной последовательности белка¹. На рис. 12.1 показана структура гена ß -цепи гемоглобина человека. Этот ген состоит из следующих элементов:

1. Область промотора, ответственная за присоединение РНК-полимеразы и последующую инициацию транскрипции. Эта область содержит, как будет показано позже, три различных элемента и располагается с 95-й по 26-ю пару оснований перед сайтом инициации транскрипции (т.е. от –95-й до —26-й).

2. Последовательность АЦАТТТГ, на которой инициируется транскрипция. Ее часто называют кэп-последовательностью. потому что она кодирует 5'-конец РНК, который получит вскоре после транскрипции группу из модифицированных нуклеотидов – кэп (о чем будет говориться ниже).

3. Кодон АТГ, инициирующий трансляцию. Этот кодон лежит через 50 пар оснований после точки инициации транскрипции. Промежуточная область из 50 пар оснований между точками инициации транскрипции и трансляции называется лидерной последовательностью.

4. Экзон, содержащий 90 пар оснований, которые кодируют аминокислоты 1–30 в ß -цепи гемоглобина человека.

¹ Известны, однако, интересные исключения (например, гены гистонов), когда таких промежуточных последовательностей в генах не содержится. Любая гипотеза, касающаяся функции этих последовательностей, должна учитывать такие исключения.

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

Рис. 12.1. Последовательность нуклеотидов в гене ß -цепи глобина человека. А. Схема локализации промотора, сайта инициации транскрипции (кэп-сайта), лидерной последовательности, экзонов и интронов в гене ß -цепи глобина. Экзоны обозначены черным цветом, числа по их краям указывают положения кодируемых ими аминокислот в β -цепи глобина. Б. Последовательность нуклеотидов в гене ß -цепи глобина от 5'- до 3'-конца мРНК. Последовательности промотора, а также сигналы инициации и терминации трансляции АТГ и ТАА заключены в рамку. Большими прописными буквами обозначены экзоны, кодируемые ими аминокислоты указаны над последовательностью нуклеотидов. Малыми прописными буквами обозначены основания в интронах. Кодоны, представленные прописными буквами за терминатором трансляции, входят в глобиновую мРНК. но не транслируются в белок. Полагают, что внутри этой области расположена последовательность, необходимая для полиаденилирования. Основание Г в первом интроне (указано стрелкой) заменено на А при одной из форм ß +-талассемии. (Последовательность из Lawn et al., 1980.)

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

__________________ МЕХАНИЗМЫ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ ГЕНОВ ______________________________ 139

Рис. 12.2. Этапы формирования ß -цепи глобина и гемоглобина.

5. Интрон из 130 пар оснований, который не содержит последовательностей, кодирующих гемоглобин.

6. Экзон, содержащий 222 пары оснований, которые кодируют аминокислоты 31–104.

7. Большой интрон – 850 пар оснований, не вносящий вклада в белковую структуру гемоглобина

8. Экзон, содержащий 126 пар оснований, которые кодируют аминокислоты 105 – 146.

9. Кодон терминации трансляции – Τ АА.

10. Транскрибируемая 3’-концевая область, которая не транслируется в белок. Эта область включает последовательность ААТААА, которая необходима для присоединения к РНК-транскрипту «хвоста» приблизительно из 200-300 адениловых остатков. Этот поли(А)-конец вставляется в РНК примерно через 20 оснований после ААУААА-мотива. Однако прежде, чем транскрипция завершается, она продолжается после ААТААА-сайта на расстояние около 1000 нуклеотидов. В случае если в ААТААА-сайте возникла какая-либо мутация, поли(А)-хвост не добавляется и транскрипция не останавливается (Logan et al.. 1987). В пределах транскрибируемой 3'-концевой области расположена последовательность энхансера (примерно 600– 900 пар оснований от ААТААА-сайта), которая необходима для временной и пространственной организации экспрессии ß -глобинового гена в предшественниках зрелых эритроцитов (Trudel, Constantini, 1987).

Изначальный ядерный РНК-транскрипт для такого гена содержит кэп-последовательность, лидерную последовательность, экзоны, интроны и 3'-нетранслируемый участок (рис. 12.2). Кроме того, оба конца транскрипта претерпевают модификацию. Концевая группа, названная кэп-группой (от англ. cap, что значит «шапочка»), состоящая из метилированного гуанозина, помещается на 5'-конце РНК. Таким образом, в отличие от предшественника мРНК, все нуклеотиды которого связаны в направлении от 5' к 3', кэп-структура присоединена в направлении от 5' к 5'. Это означает, что в ядерной РНК отсутствует свободная 5'-фосфатная группа (рис. 12.3). Молекулы зрелой информационной РНК содержат аналогичные кэп-группы, хотя остается неясным, действительно ли кэп-группа в мРНК является той самой, что была изначально получена в ядре. Известно также, что концевая 5'-кэп-группа необходима для присоединения мРНК к рибосоме (Shatkin, 1976).

3'-Конец обычно модифицируется в ядре путем присоединения хвоста примерно из 200 остатков аденилата. Эти остатки адениловой кислоты соединяются друг с другом ферментативно и добавляются к транскрипту. Они не кодируются последова-

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

140 _______________ ГЛАВА 12 ______________________________________________________________________

Рис. 12.3. Присоединение кэп-группы к 5-концу мРНК эукариот. А. Исходный 5'-конец. Б. 5'-кэп. Показано добавление к мРНК 7-метилгуанозина в направлении 5' ® 5'. Во многих мРНК наблюдается также метилирование 2-гидроксильных групп первых двух оснований. (По Rottman et al., 1974.)

Рис. 12.4. Обнаружение интронов при картировании с вытеснением петли (R-петли). Ген ß -цепи глобина мыши смешивают в формамиде с собственной мРНК. Присутствие формамида обеспечивает предпочтительную РНК – ДНК-гибридизацию, а не гибридизацию ДНК – ДНК. При замещении РНК гомологичной цепи ДНК вытесненная ДНК образует одноцепочечную R-петлю. При этом интрону, находящемуся между двумя кодирующими последовательностями, энергетически выгодно образовать двухцепочечную петлю. А. Схема, иллюстрирующая принцип картирования с R-петлей. Б. Электронная микрофотография, иллюстрирующая взаимодействие ß -глобинового гена мыши и мРНК этого гена. В сопроводительной схеме сплошными жирными линиями обозначена ДНК, а тонкой штриховой линией – ß -глобиновая мРНК. (Фотография из Tiemeier et al., 1978.)

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

__________ МЕХАНИЗМЫ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ ГЕНОВ _________________________ 141

тельностью гена. Обе модификации, 5'- и 3'-концов, могут защищать РНК от экзонуклеаз (Sheiness, Darnell, 1973; Gedamu, Dixon, 1978), стабилизируя таким образом мРНК и ее предшественник. Эти поли(А)хвосты прогрессивно укорачиваются по мере старения мРНК. Новообразованная глобиновая мРНК в клетках мыши и кролика имеет около 150 адениловых остатков, тогда как старые РНК – 100, 60 или 40 аденилатов (Merkel et al., 1975; Nokin et al., 1976). Показано, что глобиновая мРНК, лишенная поли(А), быстро разрушается после инъекции ее в ооциты Xenopus. Глобиновая мРНК с поли(А)хвостом существует в этих условиях более 20 ч (Marbaix et al., 1975).

Наличие интронов между кодирующими областями было выявлено с помощью электронного микроскопа (рис. 12.4). Информационная РНК ß -цепи глобина связывается со специфическими участками ядерного гена, выпячивая интроны. Имеются разного рода данные, что эти интроны необходимы для того, чтобы последовательности мРНК покинули ядро и попали в цитоплазму, где они могут быть транслированы в белки. Во-первых, можно сконструировать искусственные вирусы так, что в них будет встроена часть глобинового гена. Затем этим вирусам дают возможность инфицировать клетки и транскрибировать РНК в ядрах Если вирус содержит интрон (из глобинового гена или из вирусного гена), то в цитоплазме обнаруживаются стабильные последовательности глобиновой мРНК. Однако если интрон вируса или глобинового гена отсутствует, то последовательности глобиновой мРНК в цитоплазме не накапливаются (Hamer, Leder, 1979).

Во-вторых, как уже было отмечено ранее, некоторые индивидуумы страдают от болезни, называемой β ⁺-талассемией; это заболевание характеризуется недостаточной продукцией ß -цепей глобина. У больных имеются гены для ß -цепей глобина, и транскрипция предшественников мРНК на этих генах проходит, по-видимому, нормально. Более того, мРНК этих больных правильно транслируется в аминокислотную последовательность ß -цепи глобина человека. Дело заключается в количестве ß -глобиновой мРНК. Следовательно, заболевание проявляется на уровне процессинга РНК. Это было показано с помощью пульсового мечения («pulsechase») (Maquat et al., 1980). Развивающиеся эритроциты, выделенные из костного мозга больных, в течение 12 мин инкубировали с радиоактивными нуклеотидами («pulse»). Затем транскрипцию останавливали актиномицином D. Через различные интервалы времени («chase») из клеток выделяли РНК, которую подвергали электрофорезу для разделения молекул РНК по размерам, и затем гибридизовали эти РНК с ß -глобиновой кДНК. У нормальных индивидуумов вскоре после мечения появляется РНК длиной 1900 оснований. Несколько позже кДНК связывается с молекулами РНК, содержащими 1550, 1150, 960 и 880 оснований. Еще несколькими минутами позже 85% всей РНК представляет собой мРНК. В клетках от больных ß ⁺-талассемией наблюдается переизбыток промежуточных продуктов. Очень незначительная часть этих РНК имеет к 30 минутам размеры зрелой мРНК. Образовавшиеся промежуточные продукты разрушаются, вероятно, в ядре, и лишь немногие выходят в цитоплазму (Maquat el al., 1980; Kantor et al., 1980). Таким образом, β ⁺-талассемия обусловлена дефектом в процессинге предшественника ß -глобиновой мРНК. В результате секвенирования ß -глобиновых генов нескольких больных было обнаружено, что они содержат мутации в первом интроне. Мутация в одном из этих генов показана на рис. 12.1 (Spritz et al., 1981). Итак, структура интрона оказывается существенной для процессинга и транспорта РНК из ядра в цитоплазму. Механизм такого сплайсинга и его значение для дифференциальной экспрессии генов будут обсуждаться в гл. 13.