Структура и функция промотора

Для осуществления правильной транскрипции необходимы регуляторные элементы двух типов. Регуляторные элементы первого типа называют цис-регуляторами. Они представляют собой специфические последовательности ДНК на данной хромосоме. Цис -регуляторы оказывают действие только на ближние гены. Второй тип называют транс-регуляторами. Это растворимые молекулы (включая белки и РНК), которые продуцируются одним геном, а взаимодействуют с другими генами на той же хромосоме или на других хромосомах. Если обратиться к индукции генов в lac -опероне Е. coli, то можно вспомнить, что ген репрессора дает белок-репрессор, который взаимодействует с последовательностью оператора для генов lac -оперона. В этом случае оператор является цис -регуляторным элементом, так как он контролирует только lac- оперон своей собственной хромосомы. (Последовательность мутантного оператора на другой хромосоме может присоединять или не присоединять белок-репрессор.) Белок-репрессор, напротив, является транс -регулятором. поскольку он продуцируется одной хромосомой, а связывается с цис -регуляторным оператором на другой хромосоме (рис. 12.5).

В эукариотических генах, кодирующих мРНК, обнаружены два типа цис -регуляторных последовательностей ДНК – промоторы и энхансеры («усилители»). Промоторы обычно располагаются непосредственно перед сайтом, в котором начинается

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

142 _______________ ГЛАВА 12 _____________________________________________________________________________

Рис. 12.5. Схема дифференциальной регуляции гена у E. coli; показаны цис - и транс -регуляторные элементы. В клетках дикого типа индуцибельное состояние характеризуется тем, что РНК для β -галактозидазы не транскрибируется, пока отсутствует лактоза. В отсутствие лактозы белок-репрессор (R) кодируемый геном i, присоединяется к сайту оператора (о), ингибируя этим транскрипцию РНК-полимеразой с промотора (p). Если лактоза присутствует, то она связывается с белком-репрессором, в результате репрессор не может присоединиться к ДНК и транскрипция продолжается. Растворимая природа этого репрессора показана в опытах на мутантах E. Coli. Когда гаплоидные бактериальные клетки, несущие ген i–, становятся частично диплоидными с геном i дикого типа (i+), синтезируется репрессор дикого типа, который способен сделать индуцибельным исходный ген ß -галактозидазы. Этот белок-репрессор является транс -регуляторным элементом. Последовательности промотора и оператора представляют собой цис -регуляторные элементы.

Рис. 12.6. Типичный промотор для гена эукариот, кодирующего белок. Представленный ген содержит ТАТА-бокс и три 5'-элемента промотора. Примеры таких 5’-элементов представлены в нижней части рисунка. (По Maniatis et al., 1987.)

транскрипция, и длина их составляет приблизительно 100 пар оснований. Участок промотора необходим для присоединения РНК-полимеразы II и точной инициации транскрипции. Энхансер активирует утилизацию промотора, контролируя эффективность и скорость транскрипции с этого конкретного промотора. Энхансеры активируют только лежащие в цис -положении промоторы (т.е. промоторы на той же самой хромосоме), но они могут функционировать и на больших расстояниях. Кроме того, они могут находиться не только на 5'-стороне гена, но и на другой цепи ДНК (Maniatis et al., 1987).

Промоторы генов, которые транскрибируют относительно большие количества мРНК, имеют сходную структуру. В них содержится последовательность АΤ Α (называемая иногда ТАТА-боксом или боксом Голдберга–Хогнесса), располагающаяся на расстоянии приблизительно 30 пар оснований с 5'-стороны от сайта, где начинается транскрипция, и один или несколько передних элементов промотора, лежащих еще дальше с 5'-стороны. Передний элемент промотора обычно представляет собой вариацию последовательности ЦААТ, но выявлены и другие промоторные элементы (Grosschedl, Birnstiel, 1980; McKnight, Tjian, 1986) (рис. 12.6).

Впервые промотор β -глобинового гена исследовали в опытах по проверке специфической транскрипции клонированной ДНК. Клонированные гены могут транскрибироваться правильно, когда они введены в ядра ооцитов лягушки или фибробластов или когда они инкубируются с очищенной РНК-полимеразой в присутствии нуклеотидов надосадочной жидкости (Wasylyk et al., 1980). После того как транскрипция гена подтверждена, для получения специфических делений в этом гене или окружающих его участках используют рестриктазы. Затем можно выяснить, продолжает ли правильно транскрибироваться такой модифицированный ген. Результаты этих исследований показали, что для максимальной транскрипции ß -глобинового гена достаточно первых 109 пар оснований, предшествующих кэп-сайту (Grosveld et al., 1982; Dierks et al., 1983).

Другие исследователи уточнили этот вывод с помощью клонирования участка глобинового гена мыши от 106-й пары оснований выше (с 5'-стороны) старта транскрипции (положение —106) вплоть до 475-й пары оснований (положение +475) в первом экзоне (Myers et al., 1986). Эти клоны были подвергнуты мутагенезу in vitro. Таким способом в область промотора глобинового гена было введено

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

МЕХАНИЗМЫ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ ГЕНОВ 143

Рис. 12.7. Влияние отдельных точковых мутаций в промоторе ß -глобинового гена мыши на способность промотора к инициации транскрипции. Каждая линия представляет уровень транскрипции с мутантного промотора по отношению к уровню транскрипции с глобинового промотора дикого типа, определяемому в параллельных опытах. Черными точками указаны нуклеотиды, для которых не были получены мутации. Под гистограммой представлена схема, показывающая положение ТАТА-бокса и двух 5'-элементов промотора в гене ß -цепи глобина мыши. (Из Maniatis et al., 1986.)

130 различных одиночных замен оснований. Полученные клонированные гены вводили в плазмиды, содержащие энхансер, и затем с помощью трансфекции – в культивируемые клетки, которые в обычных условиях не синтезируют глобин. Будут ли в таких клетках транскрибироваться усеченные глобиновые мРНК (475 оснований) с этих клонов? Результаты опытов показаны на рис. 12.7. В большинстве случаев мутации в 5'-фланкирующей области не влияли на эффективность транскрипции глобинового гена. Однако мутации в трех кластерах нуклеотидов резко снижали транскрипцию. Один кластер находился в ТАТА-боксе (боксе Голдберга–Хогнесса), другой – в переднем ЦАAT-элементе промотора, а третий – в участке ГЦЦАЦАЦЦЦ, от 95-й до 87-й пары оснований выше кэп-сайта.

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

144 _______________ ГЛАВА 12 _____________________________________________________________________________

Во многих эукариотических промоторах ЦААТ- и ТАТА-боксы являются необходимыми элементами (Efstratiadis et al., 1980) (табл. 12.1 ), а последовательность ГЦЦАЦАЦЦЦ не наблюдается нигде, за исключением промоторов ß -глобиновых генов у нескольких видов. У человека эта последовательность является, по-видимому, критической, поскольку мутации, возникшие в ней естественным образом, полностью прекращают транскрипцию ß -глобинового гена (Orkin, Kazazian, 1984). Две мутации в положениях –78 и –79 в действительности увеличивают транскрипцию в три раза по отношению к уровню дикого типа. Полагают, что эти замены способствуют взаимодействию промотора с транс- регуляторными белками.