Сложность ядерной и цитоплазматической РНК

Следующий вопрос касается числа различных типов последовательностей РНК, присутствующих в ядре и цитоплазме. Содержится ли в ядре большее разнообразие последовательностей, чем в цитоплазме, или и там, и там разнообразие последовательностей примерно одинаковое? Ответ на этот вопрос покажет нам, какая часть генома транскрибируется в яРНК и насколько адекватно можно судить об этой части по набору мРНК. Разнообразие нуклеотидных последовательностей называют сложностью. Для измерения сложности определенное количество радиоактивной РНК добавляют к избытку денатурированной ДНК и дают им возможность ренатурировать. Чем выше сложность РНК,

¹ Термины ядерная РНК (яРНК) и гетерогенная ядерная РНК ( гяРНК) часто используются как синонимы, однако на самом деле они несколько различаются по значению. Термин гяРНК относится обычно к предшественникам мРНК (называемым иногда пре-мРНК), тогда как яРНК относится к общей нефракционированной РНК, экстрагированной из ядра. Мы будем использовать обозначение яРНК, а не гяРНК.

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

____________ КОНТРОЛЬ РАЗВИТИЯ НА УРОВНЕ ПРОЦЕССИНГА РНК _________________________________ 179

Рис. 13.2. Реассоциация нуклеиновых кислот различного происхождения. Каждая кривая представляет нормальную кинетику, ожидаемую в том случае, когда все гены присутствуют с одинаковой частотой. Так как для реакции гибридизации необходима встреча двух комплементарных последовательностей, скорость гибридизации может быть описана как dC/dt= —kС 2, где С – концентрация одноцепочечных последовательностей в момент времени t;. а k – константа реассоциации. Обратите внимание, что 0% соответствует верхнему значению оси ординат, а ось C0 t представлена логарифмической шкалой. Видно, что ДНК Е. coli содержит примерно в 100 раз больше последовательностей, чем ДНК бактериофага Т4 (По Britten, Кohne, 1968.)

тем ниже скорость ее ренатурации с ДНК. Другими словами, если присутствует только один тип РНК (сложность = 1), то эта РНК-последовательность довольно быстро распределяется в реакционной смеси, найдя свой ДНК-гомолог. Однако если это же количество РНК содержит тысячу последовательностей (сложность = 1000), то каждая индивидуальная последовательность будет в тысячу раз более разбавленной и вероятность найти свой гомолог за то же самое время будет крайне мала. Двухцепочечные ДНК–РНК-гибриды можно легко отделить от негибридизованной РНК и затем вычислить долю радиоактивной РНК, которая нашла себе комплементарную ДНК

Определение сложности обычно представляют графически в виде кривых C₀ t, причем С₀ – исходная концентрация меченой нуклеиновой кислоты (в молях на 1 л), t – время (в секундах). Степень реассо-

Рис. 13.3. Реассоциация ДНК типичного эукариотического организма. ДНК разрезают до коротких фрагментов - около 500 пар оснований и денатурируют в щелочи с целью получения отдельных цепей. Затем снижают значение pH, позволяя цепям ДНК ренатурировать. Кривая показывает быстро ренатурирующую фракцию, которая представляет высокоповторяющиеся последовательности ДНК, фракцию умеренно повторяющейся ДНК и фракцию уникальных последовательностей ДНК. Показанные на рисунке высокоповторяющиеся последовательности представлены с примерно в миллион раз большей частотой, чем уникальные гены. Высокоповторяющаяся ДНК локализована обычно в центромерах и выполняет структурную функцию. Уникальная ДНК включает в себя гены, такие, как гены ферментов и структурных белков. Умеренно повторяющаяся ДНК, как полагают, содержит регуляторные последовательности, обнаруживаемые в интронах и в 5'- и 3'-фланкирующих областях генов. (По Hood et al., 1975.1

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

180 _______________ ГЛАВА 13 ________________________________________________________________

циации должна быть функцией концентрации и времени. Поэтому долю ренатурированной РНК в процентах наносят на график относительно значения С ₀ t (рис. 13.2). Опыты такого типа были проведены как с ДНК, так и с РНК; результаты показали, что некоторые последовательности ДНК представлены в геноме миллионы раз (фракция высокоповторяющихся последовательностей), некоторые последовательности представлены тысячи раз (фракция умеренных повторов) и, наконец, некоторые ДНК (такие, как гены, кодирующие ферменты) представлены единственной копией на гаплоидный геном (рис. 13.3) (Britten, Konne, 1968).

Определенная с помощью этого метода сложность яРНК оказалась существенно большей, чем сложность мРНК из тех же клеток. Во-первых, определенные последовательности яРНК ассоциировали с ДНК очень быстро. Это означает, что они содержат РНК, транскрибированную с повторяющихся последовательностей ДНК. Цитоплазматическая мРНК из клеток бластулы морского ежа не содержит последовательности, которые гибридизуются с ДНК-повторами, тогда как приблизительно 25% яРНК, разрезанной на фрагменты размером около 1100 нуклеотидов, ассоциируют с ДНК при низких значениях С ₀ t. Исходя из того, что у морского ежа средняя длина повторов в яРНК составляет примерно 300 оснований, можно получить оценку, согласно которой 70% молекул яРНК содержат по крайней мере одну повторяющуюся последовательность (Smith et al., 1974). В том случае, если РНК гибридизовали с очищенной неповторяющейся (уникальной) ДНК (чтобы повторы не усложняли картину гибридизации), сложность яРНК обычно в 4–20 раз превосходила сложность мРНК из того же органа или типа клеток (табл. 13.1). По оценкам, полученным в таких работах, у

Таблица 13.1. Примерные кинетические характеристики и относительная сложность популяций мРНК и яРНК у различных видов

Организм
Drosophila
Aedes (комар)
Морской еж
Клетки карциномы человека (клетки HeLa)
в культуре

зародышей морского ежа только 10-20% яРНК входят в популяцию цитоплазматических мРНК. В печени крысы только 11% типов последовательностей яРНК становятся информационными РНК, а в культивируемых клетках насекомых эта оценка снижается до 5%. На основе приведенных данных можно прийти к выводу, что ядерные транскрипты содержат: 1) небольшую фракцию гяРНК, которая является предшественником мРНК клетки; 2) большую фракцию яРНК, которая очень быстро обменивается внутри ядра. Популяция молекул яРНК содержит многочисленные последовательности, отличающиеся от тех, которые проходят процессинг в мРНК