Присутствие в ядре предшественников мРНК, не прошедших процессинг

Данные, полученные на морском еже. свидетельствуют, что популяции яРНК в различных дифференцированных клетках идентичны, поэтому можно ожидать, что зонды для мРНК, специфичных для одного типа клеток, будут находить комплементарные последовательности в ядрах из неэкспрессирующих клеток. С помощью кДНК глобиновой мРНКбыли обнаружены предшественники глобиновой мРНК в общей клеточной РНК из печени, мозга и культивируемых клеточных линий мыши (Humphries et al., 1976), а также в яРНК из неиндуцированных клеток больных эритролейкозом Фрейда (Gottesfeld, Partington, 1977) и из ооцитов Xenopus (Perlman et al., 1977). Слабая транскрипция овальбуминовых генов была обнаружена в печени, селезенке, мозге и сердце курицы (Axel et al., 1976; Tsai et al., 1979). Ее уровень соответствует приблизительно одной молекуле, кодирующей овальбумин, на каждые два клеточных ядра: даже те РНК, которые, как известно, регулируются на уровне транскрипции, можно обнаружить в очень небольших количествах в ядрах клеток другой специфичности.

Некоторые из наиболее убедительных данных, свидетельствующих о контроле транскриптов РНК на уровне процессинга, получены в экспериментах с вирусами клеток мыши. В этом случае сплайсинг яРНК с образованием конкретных мРНК может осуществляться в клетках одних типов и не может в других. Вирус полиомы и вакуолизирующий обезьяний вирус 40 (SV40) инфицируют клетки и интегрируются в хозяйские хромосомы. При этом они синтезируют свою собственную РНК, которая продуцирует вирусоспецифические белки. Подобно РНК клетки хозяина, транскрипты вирусов полиомы и SV40 должны вначале подвергнуться сплайсингу, чтобы избавиться от интронов. Стабильные вирусные мРНК могут накапливаться в цитоплазме только после процессинга вирусной РНК. (Молекулы РНК некоторых других вирусов, реплицирующихся в цитоплазме, не нуждаются в сплайсинге.) Недифференцированные стволовые клетки тератокарциномы (гл. 6) непермиссивны для инфицирования и экспрессии генов вирусов полиомы и SV40. Однако, если эти стволовые клетки дифференциру-

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

186 _______________ ГЛАВА 13 _________________________________________________________

ются в клетки соматических типов, они неожиданно становятся доступными для инфицирования этими двумя вирусами. Причиной исходной непермиссивности является, очевидно, неспособность к процессингу РНК. Недифференцированные клетки тератокарциномы не осуществляют сплайсинг предшественников мРНК вируса SV40, тогда как дифференцированные клетки делают это. В стволовых клетках гигантские предшественники мРНК накапливаются и в конце концов разрушаются. Только дифференцированные клетки способны преобразовывать эту ядерную РНК в цитоплазматическую мРНК (Segal et al., 1979). Вирусы, которые не нуждаются в процессинге РНК для экспрессии генов (Синдбис и вирус осповакцины), способны к полноценному росту как в стволовых клетках тератокарциномы. так и в ее дифференцированных производных. Данные о том, что сплайсинг проходит только в дифференцированных клетках мыши (Topp et al., 1977) и производных тератокарциномы, свидетельствуют о зависимости развития клетки от экспрессии собственно ферментов сплайсинга (или их специфических ИРТ-«кофакторов»). Эти агенты, ответственные за процессинг РНК SV4O, играют, без сомнения, более подходящую для них роль в клетке и могут отвечать за процессинг некоторых предшественников мРНК. необходимых для клеточной дифференцировки.

Образование альтернативных белков на одном гене: дифференциальный процессинг РНК в иммунной системе

Дифференциальный процессинг РНК оказался чрезвычайно важным для образования ряда специфических белков. Наиболее хорошо изученные случаи относятся к образованию различных иммуноглобулинов (антител) в ходе дифференцировки В-лимфоцитов. Экспрессия генов, кодирующих антитела, в процессе развития лимфоцитов и их ответ на антиген включают в себя многочисленные события, связанные с селекцией и перестройкой генных сегментов. Эти селекция и перестройка осуществляются преимущественно на уровне ДНК (см. гл. 10 и 11). Но некоторые аспекты регуляции экспрессии генов антител проявляются на уровне процессинга РНК.

В процессе своего развития В-лимфоцит, прежде чем он станет клеткой, секретирующей антитела, синтезирует пробные антитела, которые могут секретироваться и встраиваться в плазматическую мембрану. Здесь они функционируют как рецепторы антигена. Поверхностные иммуноглобулины могут принадлежать к классам IgM или IgD в зависимости от стадии развития лимфоцита и от того, контактировал ли он с антигеном того типа, с которым реагируют его антитела. Вначале поверхностные иммуноглобулины относятся к классу IgM; после первой стимуляции антигеном они могут быть одновременно IgM и IgD; впоследствии на клеточной поверхности могут присутствовать только IgD. Но «вариабельная» (антигенсвязывающая) часть иммуноглобулина остается неизменной на протяжении всей жизни конкретного лимфоцита и его дочерних клеток. При этом, как было показано Маки и др. (Maki et al., 1981), переключение с IgM на IgD происходит на уровне процессинга РНК. Синтезируется единый РНК-транскрипт, который содержит экзоны, кодирующие вариабельную (антигенсвязывающую) область и константные области мю (IgM) и дельта

Рис. 13.10. Предлагаемая модель экспрессии IgM и IgD в В-лимфоцитах. Ген тяжелой цепи формируется в ходе развития лимфоцита путем транслокации последовательностей V-, D- и J-областей в положение рядом с последовательностями константной области. Транскрипт этого гена включает в себя обе константные области, μ (IgM» и δ (IgD), вместе с новообразованной вариабельной областью. При альтернативном процессинге могут делетироваться экзоны константной мю-области (Сμ) или экзоны константной дельта-области (Сδ). (По Liu et al., 1980.)

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

__________________ КОНТРОЛЬ РАЗВИТИЯ НА УРОВНЕ ПРОЦЕССИНГА РНК ___________________________ 187

Рис. 13.11. Последовательности аминокислот на карбоксильных концах мембранной (m) и секретируемой (s) форм IgM. А. Карбоксильные концы цепей μ s, и μ m. Б. Возможная конфигурация цепи, связанной с мембраной; эта конфигурация удерживает молекулу в клеточной мембране. Заряды аминокислот обозначены знаками «+» или «—». (По Rogers et al., 1980.)

(IgD), раздвоенные разнообразными интронами. Что будет кодировать мРНК, выходящая в цитоплазму, – IgM или IgD, зависит от того, какой из двух альтернативных механизмов сплайсинга используется. Если вырезаются и отбрасываются дельта (δ)экзоны, то будут образовываться IgM. Если при сплайсинге удаляются мю(μ)экзоны, тогда будут синтезироваться IgD. В течение переходного периода, когда используются оба механизма сплайсинга, продуцируются иммуноглобулины обоих классов (рис. 13.10).

Выбор между синтезом IgM или IgD не является единственной функцией дифференциального процессинга РНК Назначение этих белков – будут ли они встроены в плазматическую мембрану или будут секретированы – решается аналогичным образом.

IgD обычно прикреплены к клеточной мембране, и присутствие IgD в сыворотке, как считают, может являться результатом только случайной утечки или гибели клеток. Напротив, IgM может существовать в двух различных формах, мембрансвязанной (mIgM) и секретируемой (sIgM). Мембрансвязанный IgM функционирует в качестве рецептора антигена, а секретируемый IgM является первым типом антител, который обнаруживается в крови, когда организм впервые сталкивается с антигеном. Оказалось, что sIgM и mIgM отличаются друг от друга карбоксильными концами (Singer et al., 1980). Эти молекулы идентичны, за исключением того, что мембрансвязанная форма содержит гидрофобный «хвост», который удерживает ее в мембране (рис. 13.11). Молекулы мРНКдля мембранной и секретируемой форм IgM различны. Обе они транскрибируются на одном Сμ -гене, однако по-разному проходят процессинг (Rogers et al., 1980; Early el al., 1980; Alt el al., 1980). Секретируемый IgM содержит области, копируемые генами VDJ и экзонами Сμ ₁, Сμ ₂, Сμ ₃, и Сμ ₄. Помимо этого он содержит хвостовую часть, которая позволяет ему секретироваться. Мембрансвязанный IgM имеет аналогичное строение, за исключением ответственной за секрецию хвостовой части, вместо которой к нему добавлен фрагмент, кодируемый двумя дополнительными экзонами Сμ ₅, и Сμ ₆, которые формируют гидрофобный хвост,

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

188 _______________ ГЛАВА 13 _____________________________________________________________________________

Рис. 13.12 Варианты альтернативного сплайсинга, предложенные для мРНК μ -секретируемой и μ -мембранной форм IgM. Ρ включает в себя лидерную последовательность; V кодирует вариабельную область; с 5’-стороны располагаются возможные экзоны константной ß -области (IgM). РНК, удаляемые при сплайсинге (интроны), изображены штриховыми линиями. (По Early et al., 1980.)

способный встраиваться в мембрану лимфоцита. При сплайсинге РНК решается, какая из молекул будет образована, sIgM или mIgM (рис. 13.12).

Помимо этого в процессе формирования антител имеется третий этап, где дифференциальный процессинг РНК играет важную роль. В каждом В-лимфоците синтезируются молекулы лишь одного типа антител, которые кодируются только одной из двух гомологичных хромосом, имеющих такие гены. Это явление называют аллельным исключением. Что происходит с другой хромосомой, имеющей гены антител? Группа исследователей обнаружила ядерные РНК, соответствующие неперестроенным или неправильно перестроенным генам антител (Perry et al., 1980). Это наблюдение свидетельствует о том, что происходит транскрипция «неэкспрессирующихся» генов антител, которая не сопровождается процессингом с образованием мРНК.

Дифференциальный процессинг РНК: генерация новых белков в разных клетках в разное время

Дифференциальный процессинг РНК изучали наиболее интенсивно на примере экспрессии иммуноглобулиновых генов, однако было установлено, что он контролирует альтернативные формы экспрессии более чем 50 различных белков (Breitbart et al., 1987). В ряде случаев сплайсинг РНК может создавать в разных клетках различные белки. Процессинг определенного предшественника мРНК в некоторых клетках щитовидной железы поставляет мРНК для гормона кальцитонина. Однако в нервных клетках тот же предшественник мРНК проходит процессинг в мРНК для нейропептида CGRP (рис. l3.13)(Amara et al., 1982; Crenshaw et al., 1987). Это явление интересно само по себе, а также потому, что другой транскрипт после альтернативного сплайсинга генерирует в нейронах образование субстанции Р, а в тех клетках щитовидной железы, в которых синтезируется кальцитонин, субстанции К. Полагают (Crenshaw et al., 1987), что существуют специфичные для нейронов регулирующие сплайсинг факторы, которые функционируют на целом наборе предшественников, способных к альтернативному сплайсингу.

Полагают также, что сходным образом пять различных фибронектинов человека генерируются одним вариантом гена фибронектина. Разнообразные (и в ряде случаев органоспецифические) формы

Рис. 13.13. Альтернативный сплайсинг для гена кальцитонина/CGRP. В С-клетках щитовидной железы для формирования мРНК кальцитонина используются экзоны 1, 2, 3 и 4. В клетках мозга для синтеза мРНК нейропептида CGRP используются экзоны 1, 2, 3, 5 и 6. (Из Crenshaw et al., 1987.)

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

_____________ КОНТРОЛЬ РАЗВИТИЯ НА УРОВНЕ ПРОЦЕССИНГА РНК _________________________________ 189

фибронектина транслируются с разных мРНК, возникающих из предшественника фибронектиновой мРНК благодаря соединению вместе различных экзонов (Tamkun et al., 1984; Hynes, 1987). Альтернативный сплайсинг предшественников мРНК генерирует, очевидно, различные формы молекул адгезии нервных клеток N-MKA (Cunningham et al., 1987), а также фетальные и взрослые формы миозинов (Nabeshima et al., 1984; Rozek, Davidson, 1986). Таким образом, альтернативный сплайсинг РНК может создавать семейство белков, кодируемых одним геном.

Если один и тот же предшественник мРНК по-разному проходит процессинг в клетках различного типа, то можно ожидать, что образование мРНК зависит от присутствующих в этих клетках факторов процессинга РНК для тропонина Τ – белка, специфичного для мышц и обеспечивающего чувствительность актомиозина к ионам кальция, – образуется в ядре мышечной клетки при сплайсинге, соединяющем вместе определенные экзоны (Breitbart, Nadal-Ginard, 1987). Способность к правильному процессинг у предшественника РНК тропонина Т определяется, по-видимому, специфическим для мышц фактором сплайсинга. Немышечные клетки не объединяют нужные экзоны. и этого не делают также одноядерные миобласты. Лишь многоядерные мышечные трубочки содержат фактор, который может обеспечить правильный процессинг яРНК-предшественника этого специфического для мышц

белка.