Характеристика материнских мРНК

Эрик Дэвидсон и его коллеги оценили сложность ооцитной мРНК методом, аналогичным использованному ими для анализа сложности яРНК (гл. 13). РНК в большом избытке гибридизовали с денатурированной ДНК; было обнаружено, что значение С _о t для 50%-ной гибридизации пропорционально количеству имеющихся различных РНК-последовательностей.

С помощью этого анализа они подсчитали, что каждый ооцит (у представителей самых разнообразных типов животных) имеет различные последовательности в количестве, достаточном для приблизительно 1600 копий каждой из 20 000 - 50 000 типов РНК (Galau et al., 1976; Hough-Evans et al., 1977). Из клеток всех известных типов мРНК ооцита характеризуется наибольшей сложностью, и эта сложность отражает огромный потенциал ооцита к развитию. Однако лишь немногие из этих мРНК охарактеризованы. Использование бесклеточных систем трансляции и кДНК-зондов позволило идентифицировать в цитоплазме ооцита мРНК гистонов (Skoultchi, Gross, 1973) и мРНК тубулина (Raff et al., 1972). Очевидно, что продукты этих мРНК важны для образования хроматина и митотического веретена при дроблении.

Биохимические методы позволили идентифицировать мРНК для рибонуклеотид-редуктазы (фермент, необходимый для образования дезоксирибонуклеотидов из запасенных рибонуклеотидов) и для фермента вылупления (фермент, который позволяет зародышам разрушать оболочки оплодотворения) (Raff, 1980). В ооцитах двустворчатых моллюсков рибонуклеотид-редуктаза запасается необычным образом. Большая субъединица накапливается в виде белка в цитоплазме ооцита, а малая субъединица запасается в виде нетранслируемой материнской мРНК. Только после оплодотворения новосинтезированная малая субъединица может объединяться с предобразованной большой субъединицей, чтобы сформировать функциональный фермент (Standart et al., 1986). С помощью методов рекомбинантных ДНК удалось выделить запасенную мРНК для актина и других белков.

Небезынтересно, что некоторые запасенные мРНК распределены по ооциту неравномерно. Такое неравномерное распределение РНК-последовательностей мы наблюдаем в цитоплазме ооцитов улитки и оболочника, но такая же локализация наблюдается в ооцитах морского ежа и лягушки (Rodgers, Gross, 1978). И если, по данным некоторых авторов (Rebagliati et al., 1985), в цитоплазме неоплодотворенных ооцитов Xenopus большая часть материнских мРНК распределена равномерно, то некоторые мРНК локализованы либо в анимальной, либо в вегетативной области ооцита. Из этих ооцитов была экстрагирована РНК, содержащая (поли)А, и затем для перевода молекул РНК в популяцию двухцепочечных ДНК была использована обратная транскриптаза. Эти двухцепочечные ДНК были встроены в векторы для клонирования и выращены по отдельности в клетках Ε. coli. Таким путем получили около двух миллионов клонов.

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

___________ ТРАНСЛЯЦИОННАЯ И ПОСТТРАНСЛЯЦИОННАЯ РЕГУЛЯЦИЯ РАЗВИТИЯ _____________________ 211

Рис. 14.16. Демонстрация мРНК. локализованной в анимальном и вегетативном полюсах ооцита Xenopus. РНК получали из целого яйца (Я), областей анимального (А) ивегетативного (В) полюсов и фракционировали методом электрофореза в геле. РНК переносили с помощью Нозерн-блоттинга на бумажный фильтр, который инкубировали с радиоактивной ДНК клонов, полученных из кДНК. комплементарной мРНК ооцита. Радиоактивная ДНК клона Ан2 гибридизуется с мРНК, содержащейся в клетках анимального полюса и не содержащейся в клетках вегетативною полюса. Обратное распределение наблюдается для мРНК, которая гибридизуется с ДНК клона Вг1. (Вг1- РНК является той самой мРНК, которая упоминалась в гл. 8 как мРНК, кодирующая продукт, подобный фактору роста, играющему, по-видимому, важную роль в детерминации мезодермы.) (Из Reblagliati et al., 1986; фотография с любезного разрешения D. Melton.)

ДНК из этих клонов (ооцитной библиотеки Xenopus) была перенесена на два листа фильтровальной бумаги и денатурирована в условиях, обеспечивающих ее разделение на отдельные нити. Кроме того, исследователи отрезали от ооцита анимальные и вегетативные области и экстрагировали из этих частей содержащую (поли)А РНК. На этих РНК были синтезированы радиоактивные кДНК. Затем одну группу ДНК-содержащих фильтров инкубировали с кДНК для анимальных мРНК, а другую группу - с кДНК для вегетативных мРНК При измерении связывания радиоактивных кДНК оказалось, что большинство клонов связывали одинаковые количества кДНК из анимальной и вегетативной областей, свидетельствуя о равномерном распределении соответствующих мРНК. Однако около 1, 2% клонов связывали только кДНК, полученную на мРНК анимальной области, а около 0, 2% клонов связывали только кДНК, полученную на мРНК вегетативной области.

ДНК клонов, специфичных для анимальных или вегетативных мРНК, могли быть затем использованы для идентификации мРНК, локализованных в ооците неравномерно. Для этого РНК экстрагировали из целых яйцеклеток или из их анимальных или вегетативных областей и разгоняли в геле. Электрофоретически разделенные РНК переносили с помощью блоттинга (Нозерн-блоттинг) на нитроцеллюлозные фильтры и гибридизовали с радиоактивными ДНК-зондами для каждого из клонов, специфичных для определенной области ооцита.

Два из полученных результатов показаны на рис. 14.16. Таким образом, неравномерная локализация в цитоплазме предобразованных ооцитных мРНК может наблюдаться и в мозаичных, и в регуляционных яйцах.