Механизм трансляции у эукариот

Трансляция – это процесс, с помощью которого информация, содержащаяся в нуклеотидной последовательности мРНК. управляет синтезом конкретного полипептида. Этот процесс можно разделить на три этапа: инициацию, элонгацию и терминацию (рис. 14.1). На первом этапе инициации – происходит присоединение первой аминоацил-транспортной РНК и мРНК к рибосоме. Единственной транспортной РНК (тРНК), способной к инициации трансляции, является особая тРНК (тРНК,), которая несет аминокислоту метионин. Как показано на рис. 14.2, первые реакции вызывают образование инициирующего комплекса, состоящего из метиониновой инициаторной тРНК, связанной с 40S(«малой»)-субъединицей рибосомы. Эта Мет-тРНК, узнается эукариотическим фактором инициации 2 (эФИ2), который присоединяет ее к 40S-субъединице рибосомы. Отметим, что присоединение происходит в отсутствие мРНК. Следующей добавляется мРНК. Кэп-связывающий белок присоединяется к 7-метилгуанозину кэп-группы на 5'-конце мРНК, а эукариотические факторы инициации 4А и 4В прикрепляются к кэп-связывающему белку или рядом с ним. В отсутствие кэп-группы связывание мРНК с рибосомной субъединицей неполноценное (Shatkin, 1976, 1985). Рибосомная 40S-субъединица перемещается вдоль мРНК, пока не достигает кодона АУГ в правильном окружении. Было показано, что не каждый АУГ-кодон подходит для этого (Kozak, 1986). Для того чтобы остановить рибосомную 40S-субъединицу и инициировать трансляцию, важны также нуклеотиды вокруг АУГ. С помощью мутирования клонированных генов и анализа трансляции их РНК было обнаружено, что «оптимальной» является последо·

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

200 _______________ ГЛАВА 14 _____________________________________________________________________________

Рис. 14.1. Схема этапов трансляции у эукариот. На стадии инициации собираются вместе рибосомные субъединицы 40S (светлые) и 60S (серые), мРНК и инициаторная тРНК, которая находится в комплексе с аминокислотой метионином (Мет). В ходе элонгации к полисоме доставляются аминокислоты, между которыми образуются пептидные связи. Последовательность аминокислот в растущем белке определяется последовательностью нуклеиновых кодонов в мРНК. После образования в белке последней пептидной связи один из кодонов УАГ, УГА или УАА сообщает о терминации трансляции. Рибосомные субъединицы и мРНК могут использоваться в новом цикле трансляции.

вательность АЦЦ АУГ Т. Мутации среди фланкирующих нуклеотидов могут снижать трансляцию в 20 раз. Важность фланкирующей последовательности наблюдалась также in vivo. Имеется сообщение (Morle et al., 1985) о больном α -талассемией (дефицит α -глобиновых субъединиц), вызванной изменением последовательности АЦЦАУГГ на ЦЦЦАУГГ. При связывании 40S-субъединицы с АУГ в мРНК инициаторная тРНК располагается над АУГ-кодоном. Только после правильного размещения мРНК на малой рибосомной субъединице может присоединиться рибосомная («большая») 60S-субъединица.

Рис. 14.2. Стадия инициации трансляции у эукариот. Начальный комплекс образуется в результате объединения активированной инициаторной тРНК и рибосомной 40S-субъединицы; этот процесс катализируется ГΤ Φ и эукариотическими факторами инициации (эФИ) 2 и 3. После формирования комплекса на нем с помощью белка, связывающего кэп-группу и АТФ, встает на свое место рибосомная 60S-субъединица. Эти поздние этапы катализируются эФИ1, 4 и 5. (По Hershey, 1980; Shatkin, 1985.)

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

__________________ ТРАНСЛЯЦИОННАЯ И ПОСТТРАНСЛЯЦИОННАЯ РЕГУЛЯЦИЯ РАЗВИТИЯ ___________________ 201

Рис. 14.3. Индивидуальная полисома, транскрибирующая гигантскую мРНК пуфа BR2 из клеток слюнных желез Chironomus tentans. А. Электронная микрофотография полисомы, состоящей из 74 рибосом. Можно видеть синтезируемые белки, выходящие из рибосом и растущие по мере движения рибосом от 5'- к 3'-концу мРНК. Около 3'-конца располагаются рибосомы, от которых белок уже отделился. Б. Фотография полисомы при большем увеличении; полисома была растянута в ходе приготовления препарата. Можно видеть расположение мРНК относительно рибосомных субъединиц и синтезируемого полипептида. (Из Francke et al., 1982; фотография с любезного разрешения J.E.Edstrom.)

Элонгация заключается в последовательном присоединении молекул аминоацил-тРНК к рибосоме и образовании пептидных связей между аминокислотами по мере того, как они последовательно отдают свои тРНК-переносчики (рис. 14.1). После соединения аминокислот друг с другом рибосома перемещается по мРНК, экспонируя новые кодоны для связывания тРНК. Это позволяет другой рибосоме инициировать трансляцию на 5'-конце мРНК и начать свое перемещение. Таким образом, с любой мРНК связано обычно несколько рибосом. Эту структуру называют поэтому полирибосомой или, что более принято, полисомой (рис. 14.3). Терминация синтеза белка происходит, когда на рибосоме экспонируется один из кодонов мРНК УАГ, УАА или УГА. Эти триплеты нуклеотидов (называемые кодонами терминации) не узнаются молекулами тРНК и, следовательно, не кодируют ни одной аминокислоты. Однако их узнают сбрасывающие факторы, которые гидролизуют связь пептида с последней тРНК, освобождая его от рибосомы. Рибосома разделяется на две субъединицы, и цикл трансляции начинается снова.

Хотя 3'-поли(А)-хвосты молекул мРНК не транс-

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

202 _______________ ГЛАВА 14 _____________________________________________________________________

лируются, они, по-видимому, увеличивают эффективность трансляции тех мРНК, у которых они имеются. Как правило, пока мРНК находится в цитоплазме, ее поли(А)-хвост постепенно укорачивается, и если размеры его станут ниже критического, то способность мРНК к трансляции существенно снижается (Littauer, Soreq, 1982). В некоторых случаях экспрессия различных мРНК в цитоплазме может регулироваться с помощью дифференциального укорачивания поли(А)-хвостов. Этот механизм наблюдали в слюнных железах личинки Drosophila (Restifo, Guild, 1986) и в ооцитах Xenopus (Dworkin, Dworkin-Rastl, 1985). У миксомицета Dictyostelium (развитие которого рассмотрено в гл. 1) и двустворчатого моллюска Spisula дифференциальное укорачивание поли(А)-хвостов играет решающую роль в их жизненном цикле. При переходе миксомицета от вегетативного роста (амеба) к развитию (плодовое тело) транскрибируется новый набор мРНК. Одновременно резко укорачиваются поли(А)-хвосты запасенных мРНК, специфичных для вегетативной стадии. В результате новосинтезированные мРНК транслируются, а запасенные мРНК нет. Высказано предположение, что поли(А)-хвост каким-то образом поддерживает трансляцию (Palatnik et al., 1984). Эта идея согласуется с наблюдениями, что добавленная экзогенная поли(А) ингибирует трансляцию мРНК с такими хвостами (Jacobson, Favreau, 1983). Сходным образом после оплодотворения ооцита Spisula поли(А)-хвосты в молекулах мРНК, транслируемых в ооците, сильно укорачиваются, тогда как в тех мРНК, которые будут транслироваться у ранних зародышей (и которые не транслировались в ооците), удлиняются (Rosenthal, Ruderman, 1987).

Контроль на уровне трансляции при координированном синтезе белка: продукция гемоглобина

Одной из основных проблем генетической регуляции является координированный синтез нескольких продуктов с разных участков генома. Когда развивающийся эритроцит синтезирует гемоглобин, необходимо, чтобы α -глобиновые цепи, ß -глобиновые цепи и молекулы гема производились соответственно в соотношении 2: 2: 4 (рис. 14.4). Любое существенное отклонение от этого соотношения приводит к тяжелым заболеваниям.

Результаты недавних исследований показали, что пропорциональный синтез компонентов гемоглобина регулирует молекула гема. Достигается это двояким образом. Во-первых, избыток гема (т.е. гема, который не связан с белком, подобным глобину) будет выключать свой собственный синтез (Karibian, London, 1965). Осуществляется выключение

Рис. 14.4. Структура гемоглобина человека (взрослая форма), состоящего из четырех полипептидных цепей (двух α и двух β) и четырех молекул гема. (По Dickerson, Geis, 1983.)	Рис. 14.5. Регуляция синтеза гема по типу обратной связи. (По Harris, 1975.)

синтеза посредством инактивации 6-аминолевулинатсинтазы (DALA-синтазы), первого фермента на пути продукции гема (рис. 14.5). Таким образом, когда количество гема превосходит количество молекул, способных присоединить его, дальнейшая продукция гема прекращается. Во-вторых, избыток гема стимулирует синтез глобинов (Gribble, Schwartz, 1965; Zucker, Schulman, 1968). Если гем (в виде своей окисленной формы – гемина) добавляют к бесклеточной системе трансляции, в состав которой входят факторы, необходимые для трансляции мРНК (табл. 14.1), то синтез глобина значительно увеличивается (рис. 14.6). Следовательно, если для связывания гема не хватает глобинов, то избыток гема выключает свой собственный синтез и стимулирует усиленную продукцию глобинов.

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

__________________ ТРАНСЛЯЦИОННАЯ И ПОСТТРАНСЛЯЦИОННАЯ РЕГУЛЯЦИЯ РАЗВИТИЯ _________________ 203

Таблица 14.1. Компоненты бесклеточной системы трансляции в лизате ретикулоцитов кролика
Компонент	Концентрация (в 100 мкл)
Источник: London et al., 1976.

В нескольких лабораториях пытались выяснить, каким образом такая маленькая молекула, какой является гем, может регулировать синтез белка. В 1972 г. Адамсон и др. (Adamson et al., 1972) обнаружили, что стимулирующий эффект гема на синтез глобинов может быть имитирован путем добавления к системе трансляции слабосвязанных рибосомных белков. Поскольку такие смеси богаты факторами инициации трансляции, каждый фактор испытали в отдельности. Оказалось, что эукариоти-

Рис. 14.6. Трансляция глобиновой мРНК в бесклеточной системе синтеза белка из ретикулоцитов кролика. Добавление гемина вызывает резкое увеличение синтеза белка. (Из London et al., 1976.)	Рис.14.7. Влияние добавки экзогенного эукариотического фактора инициации 2 к бесклеточной системе трансляции из ретикулоцитов кролика. Добавленный эФИ 2 увеличивал синтез белка до уровня, близкого к наблюдаемому в системе, стимулированной гемином. (По Clemens et al., 1974.)

ческий фактор инициации 2 (эФИ2) восстанавливает синтез белка в трансляционной системе из лизатов, дефицитных по гему (рис. 14.7). Этот фактор инициации отвечает за связывание инициаторной тРНК и присоединение ее к рибосомной 40S-субъединице.

Какова взаимосвязь между гемом и эФИ2? Чтобы ответить на этот вопрос, лизаты, дефицитные по гему, добавляли к трансляционным системам, содержащим гем (Levin et al., 1976; Ranu et al., 1976). Было обнаружено, что добавка порции лизата, дефицитного по гему, действительно подавляет синтез глобинов в системе трансляции. Это наблюдение указывало на присутствие ингибитора. Более того, оказалось, что эта ингибирующая фракция имеет ферментативную активность. Она содержит киназу, способную фосфорилировать эФИ2.

Фосфорилирование эФИ2 в конечном итоге останавливает трансляцию. В норме, после того как рибосомные субъединицы объединяются, эФИ2 высвобождается в виде комплекса с ГДФ (Raychaudhuri et al., 1985). Это высвобождение осуществляется с помощью эФИ-2В (называемого иногда фактором циклов или фактором обмена гуанинового нуклеотида), который присоединяется к эФИ2 и удаляет его с рибосомы. Однако, когда этот фактор циклов присоединяется к фосфорилирован-

Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.

204 _______________ ГЛАВА 14 _____________________________________________________________________________

Рис. 14.8. Схема трансляционного контроля синтеза глобинов Эукариотический фактор инициации 2 истощается в результате фосфорилирования (протеинкиназой) до тех пор, пока гем не инактивирует протеинкиназу)

ной форме эФИ2, он остается связанным с эФИ2 и комплекс с эФИ2 не уходит с рибосомы (Thomas et al.. 1985; Gross el al., 1986). В результате весь фактор циклов (концентрация которого в 10-20 раз ниже, чем эФИ2) оказывается захваченным в таких неактивных комплексах. Циркуляция эФИ2 прекращается, и синтез белка останавливается. Добавление фактора циклов к лизатам, дефицитным по гему, приводит к восстановлению синтеза белка до уровня трансляционных систем, содержащих гем (Grace et al., 1984).

В итоге регуляцию синтеза глобинов гемом можно представить следующим образом (рис. 14.8).

1. В отсутствие гема специфическая протеинкиназа фосфорилирует фактор инициации 2.

2. Фосфорилированный фактор инициации 2 связывается со своим фактором циклов и не высвобождает его. В конечном счете весь фактор циклов иммобилизуется в этих комплексах. Комплекс эФИ2 – эФИ-2В остается связанным с рибосомой, и трансляция останавливается.

3. Избыточный гем способен присоединиться к протеинкиназе, инактивируя ее (Fagard, London. 1981). Инактивированная киназа не будет фосфорилировать эФИ2, поэтому трансляция не останавливается. Таким образом, синтез глобинов продолжается до тех пор, пока присутствует гем.

Трансляционный контроль синтеза глобинов не ограничивается этим. Как отмечалось в гл. 12, в диплоидной клетке имеются четыре активных α -глобиновых гена и лишь два активных ß -глобиновых гена. Если бы каждый ген транскрибировался и транслировался с одинаковой скоростью, то следовало ожидать, что количество α -глобиновых молекул вдвое превысит количество ß -глобиновых молекул. Этого, естественно, не происходит. Обнаруживается отношение 1, 4: 1 для α -мРНК: ß -мРНК, но 1: 1 для белков (Lodish, 1971). Таким образом, уравнивание количеств белков обусловлено регуляцией на уровне трансляции.

Полагают, что это уравнивание происходит на стадии инициации трансляции (Kabat, Chappell, 1977). Оказалось, что α -глобиновая мРНК конкурирует с ß -глобиновой мРНК за факторы инициации, но ß -глобиновая мРНК является лучшим конкурентом. ß -Глобиновая мРНК узнавалась более эффективно факторами инициации и поэтому транслировалась с большей частотой. Если эти две мРНК присутствовали в равных количествах и при лимитирующем количестве факторов инициации, то лишь 3% производимого белка составлял α -глобин. Однако если нефракционированную мРНК (α - и ß -глобиновую мРНК из лизированных клеток) добавляли к избытку таких факторов, то все молекулы мРНК транслировались с одинаковой эффективностью и итоговое отношение а- и ß -глобинов составляло 1, 4: 1. Результаты недавних экспериментов (Ray et al., 1983; Sarkar et al., 1984) косвенно свидетельствуют о том, что в качестве фактора инициации, ответственного за дискриминацию между двумя типами глобиновых мРНК, выступает кэп-связывающий белок. Хотя до сих пор неясно, как эта дискриминация осуществляется, известно, что на эффективность трансляции влияет вторичная структура 5’-лидерной последовательности (Pelletier, Sonnenberg, 1985). Как видно из рис. 14.9. 5'-концы α - и ß -глобиновых мРНК существенно различаются. Таким образом, правильное соотношение α -глобина, ß -глобина и гема устанавливается на стадии инициации трансляции. Итак, синтез гемоглобина подвержен регуляции на уровнях транскрипции и процессинга РНК, однако итоговая молекула формируется при тонкой координации на уровне трансляции.