Молекулярный этап развития генетики

К началу 40-х гг. генетики уже хорошо знали процессы, связанные с взаимодействием микроскопических и макроскопических структур: поведение хромосом в митозе и мейозе, законы передачи наследственных факторов в ряду поколений, влияние внешних условий на формирование отдельных признаков в процессе индивидуального развития. Но процессы, зависящие от взаимодействия субмикроскопических структур и происходящие на молекулярном уровне – химическое и физическое строение генов, механизм репродукции генов и синтеза белков-ферментов – все еще оставались неизвестными. Для решения этих вопросов объекты изучения и методы изучения, которые использовались раньше, были явно недостаточны и требовали дополнений и усовершенствований. Прорыв в решении этих вопросов произошел в результате широкого использования в генетических исследованиях новых объектов - бактерий и вирусов, которые благодаря своему быстрому размножению и простоте лабораторного выращивания позволяют использовать в опытах по изучению наследственности тысячи поколений, сменяющихся одно за другим, и миллиарды отдельных особей в каждом поколении. Кроме того, генетика стала активно использовать новейшие химические, физические и физико-химические методы для изучения свойств и структуры молекул белков и нуклеиновых кислот, для маркирования и идентификации различных классов макромолекул, а также для изучения биохимических процессов, происходящих на молекулярном уровне.

Благодаря использованию в генетических исследованиях новых объектов и новых методических подходов в 40-50-х гг. ХХ века и были получены экспериментальные доказательства генетической роли ДНК.

В 1944 г. О.Эвери, К.Мак-Леодом и М.Мак-Карти были проведены эксперименты по трансформации (переносу) признаков у пневмококка. Было выяснено, что трансформирующим агентом у пневмококков является ДНК, и, следовательно, именно этот компонент хромосом является носителем наследственной информации. Это открытие символизирует начало нового этапа в развитии генетики – рождение молекулярной генетики. В этот же период Б. Мак-Клинтоком (1947) были впервые описаны мигрирующие генетические элементы, что свидетельствовало о непостоянстве генома.

Вторым важным аргументом в пользу генетической роли ДНК было выяснение механизма размножения бактериофага Т2 в клетках кишечной палочки. А.Херши и М.Чейз в 1952 г., используя радиоактивную метку серы для белка и радиоактивную метку фосфора для ДНК бактериофага, показали, что именно ДНК проникает внутрь бактериальной клетки, а подавляющая часть ее белка остается на поверхности. Именно ДНК, а не белок, служит инфекционным элементом вирусов и отвечает за передачу наследственной информации. В этом же 1952 г. Н.Зиндер и Дж.Ледерберг открыли у сальмонеллы явление трансдукции, т.е. переноса вирусами генов хозяина, еще раз показав роль ДНК в осуществлении наследственности. Впервые о возможности трансдукции у грибков актиномицетов сообщили в 1959 г. С.И. Алиханян и Т.С. Ильина, которые в 1960 г. описали трансдукцию с помощью актинофага, выделенного из штамма Act. Olivaceus, нуждающегося в метионине, гистидине и цистине.

Третье, важнейшее доказательство генетической роли ДНК было получено в 1949 г. Г.Рисом и А.Мирским. Они обнаружили, что для клеток высших эукариот количество ДНК всегда постоянно в пересчете на гаплоидный хромосомный набор и варьирует строго пропорционально изменениям плоидности. Кроме того, изучение ДНК из различных источников показало, что ее нуклеотидный состав является видовой характеристикой организма.

Молекулярный этап развития генетики потребовал коллективных усилий представителей многих наук: генетиков, физиков, математиков, химиков и микробиологов. Результатом этого синтеза знаний стала расшифровка в 1953 г. структуры ДНК Дж.Уотсоном и Ф.Криком.

ДНК представляет собой полимерную молекулу, в состав которой входят четыре нуклеотида (аденин, гуанин, тимин и цитозин). Как показал в 1949 – 1951 гг. Э.Чаргафф, количество аденина в любой молекуле ДНК равно количеству тимина, а количество гуанина равно количеству цитозина (правило Чаргаффа). Дж.Уотсон и Ф.Крик, опираясь на это правило, обобщили данные рентгеноструктурного анализа, полученные в лаборатории М.Уилкинса и Р.Франклин, и в 1953 г. построили молекулярную модель ДНК, согласно которой ДНК представляет собой правозакрученную двойную спираль, в которой две цепи ДНК комплементарны друг другу и антипараллельны. На основании этой модели Дж.Уотсон и Ф.Крик предположили, что гены отличаются друг от друга чередованием пар нуклеотидов, и наследственная информация закодирована в виде последовательности нуклеотидов. Результатом изменения чередования пар нуклеотидов являются мутации. Предложенная модель прекрасно объясняла все известные факты о молекулярной структуре ДНК, предлагала матричный принцип ее воспроизведения (репликации), заключающийся в разъединении комплементарных полинуклеотидных цепей и последующей достройке новых, комплементарных цепей из нуклеотидов клетки. Это открытие считается началом эры современной биологии. В 1956 г. А. Корнберг осуществляет процесс репликации в лабораторных условиях.

В 1957 г. М. Мезельсон и Ф.Сталь экспериментально подтвердили предложенную Дж.Уотсоном и Ф.Криком модель матричного полуконсервативного механизма воспроизведения (репликации) ДНК в клетках бактерий.

Следующим огромным успехом генетики стала расшифровка генетического кода. Теоретические работы, в которых рассматривались возможные варианты структуры генетического кода, начались уже в 1954 г. Ответ на вопрос, каким образом четыре различных нуклеотида в составе ДНК могут закодировать 20 аминокислот в составе полипептида, мог быть только один: код триплетен, т.е. каждую аминокислоту кодирует группа из трех нуклеотидов. Экспериментальные подтверждения этому были найдены в работах Ф.Крика, Л.Барнетта и С.Бреннера в 1961 г.

Важное значение в расшифровке генетического кода имели исследования М.Ниренберга, Дж.Матеи и С.Очоа, которые предложили метод установления состава кодонов в бесклеточной системе белкового синтеза, и установили состав большинства кодонов. Однако определить последовательность нуклеотидов в кодонах этот метод не позволял.

Второй метод, предложенный М.Ниренбергом и П.Ледером, был основан на том, что промежуточными продуктами в синтезе белка являются аминокислоты, связанные с т-РНК. Тринуклеотидные матрицы с определенным чередованием оснований и были использованы ими для изучения связывания с рибосомами т-РНК, несущих аминокислоты. В результате этих исследований в 1965 г. был окончательно составлен кодовый словарь.

Расшифровка генетического кода показала, что генетическая информация хранится в виде нуклеотидных триплетов. Однако оставалось неясным, каким образом каждый кодон транслируется в соответствующую аминокислоту? Представление о том, что для реализации информации нужно дешифровать код, развивалось одновременно с идеей об обязательном участии матрицы в процессе трансляции. Однако в эукариотической клетке ядро, содержащее генетический материал, и цитоплазма, в которой на рибосомах синтезируется белок, пространственно разобщены. Из этого следует, что ДНК сама по себе не может служить матрицей, и, таким образом, должна существовать молекула-посредник, передающая информацию от ДНК к белкам. Поскольку к этому времени уже была очевидна связь между количеством РНК и уровнем белкового синтеза в клетке (работы Ж.Браше), возникло предположение, что роль такого посредника выполняет молекула РНК. Прямые доказательства роли информационной или матричной РНК были получены в 1957 г. Е.Волкиным и Е.Астраханом в опытах по исследованию инфекции бактерий Т-четными фагами, а также М. Ниренбергом и Г.Матеи в начале 60-х гг. в бесклеточной системе синтеза белка.

Теперь вставал вопрос, каким образом происходит трансляция тринуклеотидной последовательности мРНК в соответствующую аминокислоту белка? В 1955 г. Ф.Крик постулировал существование олигонуклеотида – адаптора, который может нести аминокислоту и образовывать водородные связи с кодирующей полинуклеотидной матрицей мРНК. Наличие адаптора было необходимо в связи с невозможностью обнаружить между аминокислотами и нуклеиновыми кислотами стереохимического соответствия, достаточного для обеспечения считывания кода. В 1957 г. М.Хогландом было показано, что в ходе белкового синтеза активированные аминокислоты переносятся на особый тип РНК, названной впоследствии транспортной РНК. В начале 60-х гг. адапторная гипотеза была доказана в экспериментах Ф.Шапвилля и Г.фон Эренштейна, а в 1966 г. уточнена в работе Ф.Крика.

В 1958 г. Ф.Крик сформулировал принцип передачи генетической информации: ДНК → РНК→ белок, который он назвал «центральной догмой молекулярной биологии». Основное положение этой схемы – невозможность кодирования от белков к нуклеиновым кислотам. Поэтому все попытки возродить на основе новых открытий гипотезу наследования приобретенных признаков отвергаются современной генетикой. Однако, в 1975 г. Р.Дульбеко, Г.Тимин и Д.Балтимор описали явление обратной транскрипции, т.е. передачи генетической информации от и-РНК к ДНК с помощью фермента обратной транскриптазы (ревертазы) у РНК-содержащих опухолеродных вирусов. Таким образом, в настоящее время центральная догма молекулярной биологии включает также процесс передачи информации от РНК к ДНК, но не от белка к РНК.

В 1961 г. французские ученые Ф.Жакоб и Ж.Моно открыли оперонный принцип организации генов и регуляции генной активности у бактерий. Впервые была предложена классификация генов на две группы по принципу действия их продукта: структурные гены, кодирующие белки, необходимые для выполнения структурных и ферментативных функций, и регуляторные гены, кодирующие белки, которые регулируют экспрессию других генов. Комплекс структурных генов, отвечающих за одну биохимическую реакцию, и элементов, контролирующих их экспрессию, формирует общую единицу регуляции, названную Ф.Жакобом и Ж.Моно опероном. В короткое время модель оперона оказалась в центре внимания не только генетиков, но и огромного числа биологов во всем мире, так как позволила увидеть реальный механизм регуляции активности генов.

В 1972 г. Г.Георгиевым была предложена схема регуляции экспрессии генов у эукариот. В дальнейшем было показано, что оперонной организации генов у эукариот не существует, а сами механизмы регуляции активности генов намного сложнее.

В 1977 г. П.Робертс и Ф.Шарп установили, что гены эукариот имеют мозаичную структуру и состоят из двух типов участков: экзонов, несущих информацию о структуре белка, и интронов, которые такой информации не несут. В этом же году ими было открыто явление сплайсинга.

Новая революция в генетике произошла в середине 70-х гг. Она была связана с новым синтезом знаний, полученных генетиками разных направлений: молекулярной и биохимической генетики, генетики бактериофагов, бактерий и плазмид, генетики млекопитающих.

Используя знания об организации наследственного аппарата различных модельных объектов, удалось разработать технологии манипуляций с генами, которые позже получили название генной инженерии. Таким образом, основной задачей генной инженерии (как и следует из названия) является разработка методов конструирования новых функционально активных генетических программ.

Основоположником генной инженерии считается работавший в США индийский ученый Г.Корана, который в 1969 г. синтезировал химическим путем первый ген – ген аланиновой т-РНК дрожжей, структура которого к тому времени была полностью расшифрована. В 1970 г. Г.Корана синтезировал уже первый функционально активный ген - ген супрессорной тирозиновой т-РНК, включающий его структурную часть и группу регуляторных элементов (промотор и терминатор). Таким образом, была показана принципиальная возможность искусственного синтеза генов. В дальнейшем была разработана методика искусственного синтеза гена ферментативным путем с использованием фермента обратной транскрипции.

Перед генетиками встал новый вопрос: каким образом искусственно синтезированные гены или фрагменты ДНК могут быть перенесены для клонирования в клетку-реципиент, и какие молекулы могут быть использованы в качестве таких переносчиков?

На первых этапах развития генной инженерии в качестве векторов, т.е. переносчиков клонируемых фрагментов ДНК, стали использовать бактериальные плазмиды и бактериофаги. Плазмиды – мелкие кольцевые молекулы ДНК, присутствующие в клетках бактерий, способны автономно реплицироваться, обладают способностью встраиваться в хромосому бактерии и выходить из нее; некоторые плазмиды могут переходить из одной клетки в другую.

Еще в 1962 г. В.Арбер открыл специфические ферменты бактериальной клетки, способные отличать свою ДНК от чужой (фаговой). Эти ферменты, названные рестриктазами, ограничивают возможность размножения фаговой ДНК в бактериях путем ее специфичной деградации (разрезанием в строго определенных сайтах). Для генно-инженерных работ стали использовать рестриктазы, разрезающие двухцепочечную ДНК с образованием одноцепочечных концов, получивших название «липких». Такие концы, сформировавшиеся под действием одной и той же рестриктазы, комплементарны друг другу и поэтому могут гибридизоваться между собой. В плазмиду могут быть включены природные и синтезированные гены.

Метод создания рекомбинантных плазмид-векторов был разработан П.Бергом с сотрудниками в 1972 г. В настоящее время в качестве векторов используются искусственные рекомбинантные плазмиды кишечной палочки и бактериофаги.

Формальной датой рождения генной инженерии считают 1972 г., когда группа П.Берга в США создала первую рекомбинантную ДНК in vitro, объединившую в своем составе генетический материал из трех источников: полный геном онкогенного вируса обезьян SV 40, часть генома бактериофага лямбда и ген лактозного оперона кишечной палочки. Сконструированная рекомбинантная молекула не была исследована на функциональную активность, поскольку у авторов возникли опасения, что методы генной инженерии могут привести к появлению микроорганизмов, опасных для здоровья человека.

В связи с этими опасениями в 1975 г. по инициативе группы ученых во главе с П. Бергом («комитет Берга») в США состоялась первая международная конференция по этическим проблемам генной инженерии, результатом которой явилось законодательное ограничение в ряде стран некоторых работ по генной инженерии и создание целой системы техники безопасности. Однако мораторий не остановил работ по генной инженерии и в последующие годы происходит активное развитие в этой области. Рождается новое направление – биотехнология.

В 1975 г. состоялась первая международная конференция по предупреждению опасных последствий генной инженерии,

В 1977 г. К.Итакура и Г.Бойер предприняли первую удачную попытку введения искусственно синтезированного гена гормона млекопитающих соматостатина в составе плазмиды в клетки кишечной палочки, которые стали продуцировать этот гормон. Вслед за этим, в различных лабораториях были созданы штаммы кишечной палочки, продуцируюшие гормон роста человека - соматотропин, пептидные гормоны брадикинин и ангиотензин, нейропептид лей-энкефалин, интерферон. В 1980 г. с помощью плазмиды в клетки кишечной палочки был введен ген, контролирующий синтез инсулина человека, а в 1981 г. были получены первые трансгенные мыши.

В 1978 г. группой Т.Маниатиса были созданы первые геномные библиотеки – наборы фрагментов ДНК, заключенные в вектор (фаг или плазмиду) и в совокупности представляющие весь геном конкретного вида растений или животных.

В 1985 г. был предложен новый подход к клонированию генов – метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяющий синтезировать необходимые фрагменты ДНК и затем многократно увеличивать число их копий. В результате этого из небольших количеств ДНК, сравнимых с содержанием ее в одном гене, можно получать количества ДНК, необходимые для биохимического анализа. Метод ПЦР оказался востребованным не только в молекулярной биологии и генетике, но и в истории, этнографии и криминалистике. Так, используя ничтожные количества ДНК, содержащиеся на костях предков человека и покрывалах мумий, оказалось возможным наработать объемы ДНК, в результате анализа которых были сделаны выводы о формировании, эволюции и миграциях предков современных людей.

С конца 70-х гг. начинаются работы по секвенированию, т.е. определению нуклеотидных последовательностей геномной ДНК. Методы секвенирования, предложенные в 1977 г. Ф.Сенгером, А.Максамом и У.Гилбертом, легли в основу грандиозных геномных проектов, целью которых стало клонирование всей геномной ДНК того или иного вида с полным определением последовательности ее нуклеотидов. В 1988 г. по инициативе генетиков США создаётся международная организация «Геном человека».

В 1995 г. был расшифрован геном микоплазмы, в 1997 г. - геном кишечной палочки, в 2000 г. – геном дрозофилы, в 2001 г. – «черновой вариант» генома человека (нуклеотидные последовательности эухроматиновых районов хромосом). К 2004 г. были секвенированы геномы многих других организмов, в том числе около 600 видов бактерий, геномы дрожжей, нематоды, мыши. Возник новый раздел генетики, посвященный изучению целых геномов живых организмов, - геномика.