Мікробіологічні основи генної інженерії, генно-інженерні процеси у медицині.

Генетика мікроорганізмів як навчання про спадковість і мінливість має характерні риси, що відповідають їхній будівлі і біології. Найбільш вивчена генетика бактерій, характерними рисами яких є малі розміри і велика швидкість розмноження бактеріальної клітки, що дозволяє простежити генетичні зміни протягом невеликого проміжку часу на великому числі популяцій. Бактеріальна клітка має одинарний набір генів (немає алелей). Хромосома бактерій є полінуклеотидом (два полинуклеотидні ланцюжки ДНК) довжиною 1000 мкм і мол. масою близько 1, 5.2-10'Д. Вона суперспіралізована і замкнута в кільце: містить від 3000 до 5000 генів. Аналогічно хромосомі в цитоплазмі бактерій розташовуються ковалентні замкнуті кільця ДНК, називані плазмідами (позахромосомні фактори спадковості). Маса плазмін значно менше маси хромосом. Хромосома і плазміда здатні до автономного самокопіювання, реплікації, тому їх називають репліконами. Властивості мікроорганізмів, як і будь-яких інших організмів, визначаються їхнім генотипом, тобто сукупністю генів даної особи. Термін геном у відношенні мікроорганізмів майже синонім поняття генотип. В основі мінливості лежить або зміна реакції генотипу на фактори навколишнього середовища, або зміна самогогенотипа в результаті мутації чи генів їхньої рекомбінації. У зв'язку з цим фенотипову мінливість підрозділяють на спадкову і неспадкову.

Значення генетики мікроорганізмів: розробка патогенетичних основ лікування і профілактики інфекційних хвороб, способів діагностики (полімеразна ланцюгова реакція, Днк-зонди), створення профілактичних, лікувальних і діагностичних препаратів.

Неспадкова (модифікаційна) мінливість зумовлена впливом позаклітинних факторів на прояв генотипу. При усуненні фактора, що викликав модифікацію, дані зміни зникають. Спадкоємна (генотипова) мінливість, зв'язана з мутаціями - мутаційна мінливість. Основу мутації складають зміни послідовності нуклеотидів у ДНК, повна чи часткова їхня втрата. Спадкоємна мінливість, зв'язана з рекомбінаціями, називається рекомбінаційною мінливістю.

Рекомбінація. виникнення нових послідовностей ДНК у результаті розривів і наступних відновлень її молекул. У підсумку таких змін ДНК бактерій з'являються так називані рекомбинантные штами, чи рекомбинанты. На мікробних об'єктах були відкриті форми переносу генетичного матеріалу - трансформація, трансдукція, кон'югація. У бактерій розрізняють три типи рекомбінацій: загальну, незаконну і сайт-специфическую. Загальна, чи гомологичная, класична, рекомбінація відбувається, якщо в структурі взаємодіючої ДНК маються гомологичные ділянки. Незаконна рекомбінація для свого здійснення не вимагає значної гомології ДНК взаємодіючих структур.

Сайт-специфическая рекомбінація відбувається в менш протяжних ділянках генома (у

межах 10.20 пар нуклеотидов.

Мутації - наслідувані зміни в генотипі, не зв'язані з явищами рекомбінацій. Мутації визначаються змінами послідовності нуклеотидов у ДНК. Зміни послідовності нуклеотидов у ДНК можуть бути наслідком різних процесів: помилка при реплікації, випадання ділянок (делеция), переміщення окремої ділянки щодо іншого (транслокация) і ін.

Типи мутацій. По походженню мутації можуть бути спонтанними чи індукованими. Перші виникають без втручання експериментатора, другі. у результаті впливу мутагенів на бактеріальну популяцію, тобто фізичних, хімічних чи біологічних факторів, здатних викликати мутацію. До мутагенів відносяться різні види радіації, температура, ряд хімічних сполук. Мутації, що виникають у геноме дикого типу в бактерій у природних умовах обитания, називаються прямими. Мутації, що завершуються поверненням від мутантного типу до дикого, називаються зворотними, чи реверсією. Особи, що виникли в результаті зворотних мутацій, називаються ревертантами.

Однієї з форм мутацій є дисоціація (від лат. dіssocіatіo - розщеплення) - виникнення в популяції мікроорганізмів особей, що відрізняються від вихідних мікроорганізмів зовнішнім виглядом і структурою колоній, так званих S-и R-форм S-форми колоній - круглі, вологі, із блискучою гладкою поверхнею, рівними краями; R-форми утворять колонії неправильної форми, непрозорі, сухі з зазубреними краями і нерівною шорсткуватою поверхнею.

Множинна реактивация - процес взаємодії вірусів з поразкою різних генів, у результаті якого взаємодіючі вирионы доповнюють один одного завдяки генетичній рекомбінації, утворити неушкоджений вірус. Рекомбінація. обмін генетичним матеріалом між вірусами. можлива у виді обміну генами (межгенная рекомбінація) чи ділянками того самого гена (внутриген-ная рекомбінація). У вірусів рекомбінація відбувається в процесі зараження двома чи більш типами вірусів, що відрізняються друг від друга по генетичних ознаках. Варіантом рекомбінації є перехресна реактивация, чи кроес-реактивация, що відбувається в тому випадку, коли в одного зі штамів вірусу частина генома ушкоджена, а інший геном нормальний. При змішаній інфекції двома такими вірусами в результаті рекомбінації з'являються штами вірусу з властивостями батьківських мікроорганізмів.

Використання у медицині: перш за все-інсулін, інтерферон і гормон росту-соматотропін. Є можливість виробляти і інші препарати, але найбільш ефективними і економічно вигідними виявились описані вище. Генна інженерія (Гі) – розділ молекулярної біології який вивчає можливості і методи створення експерементальним шляхом нових генетичних структур. Гі допамагає розвитку біотехнології (виробництво за допомогою мікробів різних речовин і продуктів – антибіотиків, ферментів, гормонів, вітамін) За допомогою Гі проводять наукові дослідження на молекулярному рівні. Для досягнення мети в генній інженерії викор такі способи: злиття соматичних клітин (не статевих), перенесення ядер з клітини в клітину, перенесення хромосом або їх фрагментів, або окремих генів. Основні етапи генно-інженерних структур: 1.одержання потрібного виду: а) виділення з геном за допомогою плазмід або ферментів рестириктаз; б)синтез ДНК гена на РНК клітини або штучний синтез. 2. зєднання гена з вектором для переносу – з бактеріофагом, плазмідою, траспозонами. 3.вбудовування гена в клітину реципієнта, зшивка в геномі за допомогою фермента лігоз. 4.створення умов для активного або пасивного розмноження клітин реципієнта та виділення нових речовин. У ролі реципієнта використовують кишкову паличку Candida або дріжджі як сукарітичний геном.

16. Антибіотики, визначення, історія відкриття, принципи одержання, біотехнологія антибіотиків Антибіотики — речовини мікробного, тваринного, рослинного походження, їх синтетичні чи напівсинтетичні аналоги і похідні, які вибірково пригнічують життєдіяльність мікроорганізмів, вірусів, найпростіших, грибів, а також затримують ріст пухлин. Перший ефективний антибіотик (пеніцилін) (Гр+) відкритий Флемингом у 1929 р. 2-й антибіотик (стрептоміцин) (Гр-) відкрив Висман. У 40х роках ХХ стол широко ввійшли в мед практику. Але на даному етапі розвитку медицини деякі країни відмовилися від використання антибіотиків через великий список побічних дій. Основні принципи технології одержання антибіотиків. 1. Пошук і селекція штаму-продуцента. Як правило, для вироб­ництва застосовують штами-мутанти, одержані при радіаційному му­тагенезі. Продуктивність цих штамів у сотні і тисячі раз вища від природного попередника.2. Підбір умов культивування та відповідних середовищ. Виро­щування штаму-продуцента ведуть у ферментерах, як правило, гли­бинним методом, часто за безперервними технологіями, що дозво­ляють відбирати середовище з продуктом протягом усього виробни­чого циклу.3. Виділення антибіотика з культуральної рідини: фільтрування, екстракція органічними речовинами, адсорбція на іонообмінних смо­лах із наступним вимиванням.4. Очистка одержаного препарату. Ведеться різними фізико-хімічними способами, препарати не повинні містити продуктів життє­діяльності клітин-продуцентів та компонентів середовища. 5. Перевірка на біологічну активність (використовуються перед­бачені технічними умовами та регламентом виробництва тестові мікроорганізми). 6. Стандартизація. Активність антибіотика вимірюється в міжна­родних одиницях (МО) — специфічна активність щодо тестового мікроорганізму, яка відповідає 1 мкг чистого препарату антибіотика. Для пеніциліну 1 МО (оксфордська одиниця) — найменша кількість препарату, що затримує ріст стандартного штаму стафілокока (штам 209) в 1 мл середовища. Вона дорівнює 0, 6 мкг чистого препарату.

17. Явище антагонізму у мікробів, розвиток вчення про антагонізм. Класифікація антибіотика за механізмом і спектром дії на організм. За механізмом дії: 1. Інгібітори снтезу клітинної стінки мікроорганіхмів: пеніциліни, цефалоспорини, киклосерин, ванкоміцин, бацитрацин. 2. Інгібітори функції мембран та антибіотики, які мають детергентні властивості: поліміксини, новобіоцин, полієни (ністатин, амфотирицин Б). 3. Інгібітори синтезу білка та функції рибосом: тетрацикліни, хлорамфенікол (левоміцитин), аміноглікозиди, макроліди, лінкоміцин. 4 Інгібітори метаболізму нуклеїнових кислот: а) інгібітори РНК-актиноміцини, антибіотики групи ауреолової кислоти, антрацикліни, новобіомицин; б) інгібітори ДНК – мітоміцин С, брунеоміцин, новобіоцин, лінкоміцин. За спектром дії: 1. Активні по відношенню до Гр+ МіО особливо: бензилпеніцилін, напівсинтетичні пеніциліни та цефалоспорини, макроліди, фузидін, лінкоміцин. 2. Широкого спектру діїактивні до Гр+ та Гр- МіО: напівсинтетичні пеніциліни, цефалоспорини 2-го—4-го по­колінь, тетрацикліни, хлорамфенікол. Аміноглікозиди та поліміксини діють переважно на грамнегативні бактерії.3. Протитуберкульозні: стрептоміцин, канаміцин, віоміцин (флоріміцин), циклосерин та ін. 4. Протигрибкові: ністатин, реворин, амфотерицин Б, грізеофульвін та ін. 5. Активні за дією до найпростіших: Фугамілін, трихоміцин, паромоміцин (мономіцин) 6. Протипухлинні: актиноміцетин, група ауреолової кислоти, антрацикліни.

Антагонізм мікробів виявляється в тім що при вирощуванні в живильному середовищі різних видів один з них має здатність придушувати ріст і розмноження іншого.

18. Селекція МіО Для удосконалення продуктивності використовують селекцію. Рентген променями і хім. речовинами прискорюють мутагенний процес шляхом добору раси (виробничі штами). Таким чином підвищується вихід зокрема антибіотиків. Створення штамів МіО дозволило добувати стимулятори росту, АМК, вітамінів, ферментів. Проведення вибирають в оточуючому середовищі потрібний продуцент. Потім іде пошук і зміна штаму шляхом впливу на гени. Методи: штучний добір, гібридизація. В результаті неспорідненого схрещування з кожним наступним поколінням підвищує гетерозиготність нащадків. Це значно підвищує продуктивність МіО.